STK11互作蛋白LOH12CR1功能的初步研究.pdf

1、Peutz-Jephers綜合癥(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)是以多發(fā)性錯(cuò)構(gòu)瘤樣胃腸道息肉和粘膜色素沉著為主要臨床表現(xiàn)，且具有高度腫瘤易感性的常染色體顯性遺傳性疾病，抑癌基因STK11(也稱(chēng)之為L(zhǎng)KB1)是PJS的致病基因。STK11的編碼產(chǎn)物是長(zhǎng)為433aa的絲/蘇氨酸蛋白激酶STK11，在胞漿胞核均有分布。 互作蛋白的發(fā)現(xiàn)為了解STK11的功能及解釋PJS高度腫瘤易感機(jī)制起到了重要作用。STK11與

2、P53存在相互作用，STK11以依賴(lài)于p53的方式來(lái)促進(jìn)細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶p21的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞周期阻滯作用，同時(shí)通過(guò)P53的介導(dǎo)，過(guò)表達(dá)的STK11還可以轉(zhuǎn)定位于線(xiàn)粒體膜，經(jīng)線(xiàn)粒體途經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡二與STRAD、MO25結(jié)合形成異三聚體的STK11激酶活性明顯增強(qiáng)，磷酸化激活下游底物如AMPK促進(jìn)分解代謝，或AMPK相關(guān)蛋白MARK3/PAR1A參與細(xì)胞極性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他與STK11互作的蛋白質(zhì)如Brg-1、LIP-1、

3、FLIP-1、AGS3等也同時(shí)提示STK11可能從多個(gè)路徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡、能量代謝和細(xì)胞極性形成等生理過(guò)程。 我們?cè)捎肎ST Pull down技術(shù)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)在L02細(xì)胞中篩選并驗(yàn)證了STK11新的功能未知的互作蛋白LOH12CR1。進(jìn)化上高度保守的LOH12CR1是否具有較為重要的功能是我們所關(guān)注的問(wèn)題，因此我們?cè)谏镄畔W(xué)分析的基礎(chǔ)上，利用EGFP分子標(biāo)簽觀察LOH12CR1在細(xì)胞內(nèi)的定位，同時(shí)利用Realti

4、me-PCR檢測(cè)LOH12CR1在多種細(xì)胞株中的表達(dá)水平，并進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制和細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)觀察了LOH12CR1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響。 研究發(fā)現(xiàn)：①LOH12CR1這個(gè)進(jìn)化上高度保守的“孤兒”蛋白可能存在下列翻譯后修飾位點(diǎn)：LOH12CR1不屬于任一已知蛋白家族，其蛋白序列中不存在與已知的蛋白功能模序相匹配的結(jié)構(gòu)域，但可能存在1個(gè)N端豆蔻?；稽c(diǎn)、2個(gè)N端糖基化位點(diǎn)、一個(gè)CK2磷酸化位點(diǎn)；②LOH12CR1主要

5、定位于胞漿：共聚焦顯微鏡下觀察分別過(guò)表達(dá)pEGFP-C2-LOH12CR1重組蛋白的L02(STK11陽(yáng)性表達(dá))、HeLa(STK11陰性表達(dá))細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)綠色熒光均主要呈粗斑點(diǎn)狀散布于胞漿之中，極少數(shù)可見(jiàn)定位于胞核內(nèi)。兩種細(xì)胞中，外源性L(fǎng)OH12CR1的定位相同，提示STK11的內(nèi)源性表達(dá)可能并不影響LOH12CR1的亞細(xì)胞定位；⑨LOH12CR1在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)：Realtime-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LOH12CR1在所選取的L02、C

6、OS7、Be17402、HMC、Huh-7、Hela、Hela-WT、HL60、HT-29、及HCT116細(xì)胞株中均有表達(dá)。LOH12CR1在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)水平較在HeLa-STK11+中高出5.79倍(P<0.05)，這提示STK11的穩(wěn)定表達(dá)可能下調(diào)LOH12CR1的表達(dá)水平；④LOH12CR1具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的作用：過(guò)表達(dá)LOH12CR1的HeLa、HCT116細(xì)胞克隆形成率和生長(zhǎng)活性均明顯降低，這提示LOH12CR1