類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）在血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠肝臟內(nèi)的表達(dá)及意義.pdf

1、類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenicacuteregulatoryprotein，STAR)首先是在類固醇激素生成組織中發(fā)現(xiàn)的，對(duì)類固醇激素合成具有重要限速作用。StAR可介導(dǎo)膽固醇由線粒體外膜轉(zhuǎn)到線粒體內(nèi)膜，之后膽固醇在線粒體內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為極性更強(qiáng)、更易流出細(xì)胞的氧化固醇。因此StAR有助于膽固醇流出，可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程。 隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)StAR除了存在于類固

2、醇激素生成組織外，還表達(dá)于其他組織中，其中研究最多的是肝臟。在肝細(xì)胞中，StAR同樣具有將膽固醇由線粒體外膜轉(zhuǎn)入內(nèi)膜的作用，是膽汁酸酸性合成途徑的限速步驟。更有意義的是在這個(gè)過程中所產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性氧化固醇(oxyster01)，其對(duì)維持血漿膽固醇代謝平衡有重要作用，可通過核內(nèi)固醇類受體調(diào)節(jié)維持膽固醇代謝平衡關(guān)鍵基因的表達(dá)，以達(dá)到預(yù)防和治療諸如動(dòng)脈粥樣硬化等與脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)疾病的目的。 脂質(zhì)代謝紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要發(fā)病環(huán)節(jié)

3、，而血管內(nèi)皮細(xì)胞則是其發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)。維持膽固醇代謝平衡是預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的有效手段。如果血管內(nèi)皮細(xì)胞可將過多的膽固醇等脂類物質(zhì)由細(xì)胞內(nèi)排出，可阻止過多的脂質(zhì)進(jìn)一步向內(nèi)皮下沉積，進(jìn)而阻止或減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。因此，本文研究StAR在體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞膽固醇代謝中的作用，并利用apoE基因敲除小鼠復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化模型在體內(nèi)研究StAR在小鼠中的表達(dá)及意義，從而為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們的實(shí)驗(yàn)

4、主要分以下四部分： 第一部分：建立大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，用血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能基因芯片研究原代培養(yǎng)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞特征，為研究心血管疾病奠定基礎(chǔ)。在本室前期工作的基礎(chǔ)上，利用植塊法培養(yǎng)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞；利用倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征：利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表面標(biāo)志；用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；用血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能基因芯片研究細(xì)胞基

5、因表達(dá)譜，并比較原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化。結(jié)果顯示：利用植塊法培養(yǎng)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞具備多種典型微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascularendothelialcell，MVEC)特征：細(xì)胞呈多邊形或梭形并呈鋪路石樣生長(zhǎng)；存在管腔樣結(jié)構(gòu)(tube-likestructure，TLS)和毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞表面有豐富的微絨毛：CD34、CD31、CDl05、vW因子和Tie-2陽(yáng)性：多種與正常血管功能密切相關(guān)的基因不同程度表

6、達(dá)，前2代細(xì)胞特征穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，用植塊法培養(yǎng)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，具備微血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征，原代和第2代培養(yǎng)細(xì)胞特征穩(wěn)定，可用于心血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。比較原代及多次傳代細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞在多次傳代后失去血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征，不再適合作為血管內(nèi)皮細(xì)胞使用。 第二部分：研究血管內(nèi)皮細(xì)胞中StAR的表達(dá)及脂類物質(zhì)對(duì)其的調(diào)節(jié)，為進(jìn)一步闡明StAR在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。通過免疫化

7、學(xué)方法研究血管內(nèi)皮細(xì)胞中StAR的表達(dá)和定位，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、Westernblot方法觀察游離膽固醇(cholesterol，CHO)、低密度脂蛋白(1ow-densitylipoprotein，LDL)及25-羥化膽固醇(25-hydroxycholesterol，25-OH)三種脂類物質(zhì)對(duì)bend．3細(xì)胞中StARmRNA及蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ratmyocardialmicr

8、ovascualrendothelialcell，RMMVEC)、bend．3細(xì)胞、人主動(dòng)脈內(nèi)膜及人結(jié)締組織小靜脈內(nèi)皮中均有StAR的表達(dá)，并主要定位于胞漿中。三種脂類物質(zhì)對(duì)bend．3細(xì)胞中StARmRNA及蛋白的影響存在明顯的時(shí)間和劑量相關(guān)性。mRNA結(jié)果顯示：加入10μg／mlCHO4小時(shí)后，StARmRNA達(dá)最高水平(與對(duì)照組相比，P＜0．05)，之后逐漸降低，在24小時(shí)回到基礎(chǔ)水平；加入15μg／mlLDL后，StARmRNA

9、也在4小時(shí)達(dá)到高峰(與對(duì)照組相比，P＜0.05)，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低；而加入lOgg／ml25-OH則在12小時(shí)達(dá)到最高(與對(duì)照組相比，P＜0.01)。在劑量依賴實(shí)驗(yàn)中，CHO、LDL以及25-OH作用最強(qiáng)濃度分別為10p．g／ml(與對(duì)照組相比，P＜0.05)、15μg／ml(與對(duì)照組相比，P＜0.01)和10μg／ml(與對(duì)照組相比，P＜0.05)。蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示：加入lOμg／mlCHO8小時(shí)后，StAR蛋白達(dá)最高水平(與

10、對(duì)照組相比，P＜0.05)，之后逐漸降低；加入15μg／mlLDL后，StAR蛋白在24小時(shí)達(dá)到高峰(與對(duì)照組相比，P＜0.01)；而加入10μg／ml25-OH時(shí)在4小時(shí)達(dá)到最高(與對(duì)照組相比，P＜0.05)。在劑量依賴實(shí)驗(yàn)中，CHO、LDL以及25．OH作用最強(qiáng)濃度分別為10μg／ml(與對(duì)照組相比，P＜0.05)、15μg／ml(與對(duì)照組相比，P

11、、bend．3細(xì)胞、人主動(dòng)脈內(nèi)膜及人結(jié)締組織小靜脈內(nèi)皮中均有StAR的表達(dá)，并主要定位于胞漿中；CHO、LDL和25-OH可上調(diào)StAR在bend．3細(xì)胞中的表達(dá)，并呈時(shí)間和劑量依賴性。 第三部分：在bend．3細(xì)胞中利用腺病毒載體過表達(dá)StAR，研究StAR對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響。通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白--ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1及G1(ATP-bind

12、ingcassettetransporterAl／G1，ABCAl／ABCGl)mRNA及蛋白表達(dá)的變化，觀察過表達(dá)StAR后對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中膽固醇排出的影響。結(jié)果顯示：利用腺病毒表達(dá)載體可有效感染bend．3細(xì)胞，感染效率達(dá)96％以上，實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Westernblot的方法證實(shí)bend．3細(xì)胞中有StAR基因及蛋白的過表達(dá)。用含StAR全長(zhǎng)cDNA的腺病毒感染bend．3細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCAlm

13、RNA是對(duì)照組1．5倍(與不加病毒對(duì)照組及空病毒載體組相比，P＜0.05)，其蛋白表達(dá)水平是對(duì)照組的3倍(其中與不加病毒對(duì)照組相比P＜O.01，與空病毒載體組相比P＜0.05)。同時(shí)ABCGlmRNA表達(dá)升高，是對(duì)照組的1．8倍(與不加病毒對(duì)照組及空病毒載體組相比P＜0.01)，蛋白水平表達(dá)也升高，是對(duì)照組的1．9倍(與不加病毒對(duì)照組及空病毒載體組相比P＜0.01)。結(jié)果表明，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)StAR可促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC

14、Al及ABCGl基因及蛋白表達(dá)增高，可通過增加血管內(nèi)皮細(xì)胞中膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，來減少內(nèi)皮細(xì)胞中膽固醇的聚集。 第四部分：研究StAR在apoE基因敲除小鼠中的表達(dá)及意義，并觀察血脂及年齡對(duì)其影響，為進(jìn)一步探討脂質(zhì)代謝紊亂在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用奠定基礎(chǔ)。利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Westernblot方法觀察不同年齡、性別小鼠肝臟中StARmRNA及蛋白表達(dá)的變化，利用血脂檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血脂水平。結(jié)果顯示：在C57BL／6J小鼠中

15、，隨年齡增長(zhǎng)血脂含量無明顯變化；StARmRNA及蛋白表達(dá)在1月齡達(dá)到最高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在apoE基因敲除小鼠，隨年齡增長(zhǎng)血脂逐漸升高，尤以低密度脂蛋白膽固醇(10w-densitylipoproteincholesterol，LDL-C)增高為顯著(其中3月齡及5月齡VS．1月齡P＜0.01，5月齡VS．3月齡P＜0.01)；StARmRNA及蛋白表達(dá)呈現(xiàn)先增高后降低，1月齡較新生小鼠表達(dá)增高(與新生鼠比較P＜0.05)，在3月齡

16、中表達(dá)最高(與新生鼠比較P＜0.01)，到5月齡時(shí)表達(dá)較3月齡小鼠降低(與3月齡小鼠比較P＜O.01)。與C57BL／6J小鼠相比，apoE基因敲除小鼠血脂明顯增高(P＜O.01)，肝臟中StARmRNA表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的C57BL／6J小鼠(其中新生與1月齡小鼠P＜0.01，3月齡及5月齡小鼠P＜0.05)，而StAR蛋白在2種小鼠中表達(dá)無明顯差異。結(jié)果顯示StAR在體內(nèi)的表達(dá)與年齡及血脂有一定的聯(lián)系。 綜上所述，本研究結(jié)果提

17、示：本室用植塊法培養(yǎng)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，具備微血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征，原代和第2代培養(yǎng)細(xì)胞特征穩(wěn)定；在RMMVEC、bend．3細(xì)胞、人主動(dòng)脈內(nèi)膜及人結(jié)締組織小靜脈內(nèi)皮中均有StAR的表達(dá)，并主要定位于胞漿中；CHO、LDL和25-OH可上調(diào)StAR在bend．3細(xì)胞中的表達(dá)，并呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系；StAR可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCAl及ABCGl的表達(dá)，從而可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的排出，減少膽固醇的聚集；StAR在體