肝細(xì)胞膜受體GRP78的真原核表達(dá)及功能研究.pdf

1、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白前體78(GRP78)最早是從細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被發(fā)現(xiàn)的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的GRP78主要的生物學(xué)功能是參與鈣平衡的調(diào)節(jié),新生蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜遷移以及蛋白質(zhì)的折疊,成熟,轉(zhuǎn)運(yùn)及逆轉(zhuǎn)運(yùn)等。除了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外,細(xì)胞的膜上也有GRP78表達(dá)。有研究者提出細(xì)胞膜上的GRP78可以作為受體分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子而存在。而隨后的研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn):GRP78是2型登革熱病毒在肝細(xì)胞膜上的受體復(fù)合物的成分之一,也是A9型科薩奇病毒的共受體分子之一,細(xì)胞

2、表面的GRP78分子在信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗原的呈遞等方面都有作用。
　　 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)的感染是威脅人類(lèi)生命健康的全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。我們對(duì)HBV基因的組成、復(fù)制、抗原的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性等方面已經(jīng)有比較深入的了解,但是由于缺乏合適的體外感染的模型使我們對(duì)HBV早期的感染過(guò)程,如HBV的黏附、脫殼等過(guò)程都沒(méi)有深入的了解。目前絕大多數(shù)的研究都認(rèn)為HBV主要可能是通過(guò)病毒表面的大蛋白(lar

3、ge surface HBV antigen,LHBs)preS1特異性地與人肝細(xì)胞膜上的特異受體發(fā)生識(shí)別和黏附,從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),啟動(dòng)病毒的復(fù)制周期。本課題組在前期研究中以重組的融合蛋白GST-preS1為探針蛋白,采用pull down的技術(shù)直接分離出能夠與preS1結(jié)合的HepG2細(xì)胞膜蛋白成分,并進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜分析,鑒定出該蛋白為GRP78。
　　 本課題首先利用了熒光抗體標(biāo)記的技術(shù),通過(guò)激光共聚焦顯微鏡(Lase

4、r scanning confocal microscope,LSCM)觀察到了GRP78在HepG2的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿中均有表達(dá),在細(xì)胞膜上呈均勻的分布,證實(shí)了GRP78是HepG2細(xì)胞的膜成分之一。我們利用了RT-PCR方法直接從HepG2細(xì)胞中擴(kuò)增出GRP78的cDNA序列,利用了基因重組技術(shù)將GRP78及其分段表達(dá)的GRP78N,GRP78C與His標(biāo)簽在原核系統(tǒng)中進(jìn)行融合表達(dá),成功的構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒PW28-GRP78,PW2

5、8-GRP78N和PW28-GRP78C,并成功的誘導(dǎo)了重組蛋白His-GRP78、His-GRP78N、His-GRP78C的原核表達(dá)及純化。利用實(shí)驗(yàn)室原有的原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST-preS1重組的融合蛋白為配體蛋白,采用pull
　　 down技術(shù)和間接ELISA的方法檢測(cè)GRP78與其分段表達(dá)的融合蛋白與preS1的體外結(jié)合試驗(yàn)。結(jié)果顯示preS1可以與GRP78特異性地結(jié)合,特別是與GRP78的N段,與His標(biāo)簽無(wú)關(guān),