納米二氧化硅致肺毒性及其機制的實驗研究.pdf

1、納米材料可以穿透血腦屏障、血眼屏障及血睪屏障，從而可能危害到生物體的安全。研究表明納米材料可以在細胞水平、亞細胞水平、基因、蛋白水平及整體動物水平對生物體產(chǎn)生影響。與同種物質微米級的顆粒比較，一般納米顆粒的生物活性更強，對機體的潛在危害也可能更大。
　　 2009年9月北京朝陽醫(yī)院宋玉果的研究團隊在《歐洲呼吸病學雜志》(Eur Respir J2009，34(3)：559)上發(fā)表了題為《暴露于納米顆粒環(huán)境中可能造成胸腔積液、肺纖

2、維化和肉芽腫》的論文，首次報告了納米顆粒致人死亡的案例。引起了歐美多國專家的熱議和質疑，《Nature》也在線發(fā)表了一篇社論文章關注此事。該研究把關于納米技術的健康風險的爭論推上了新的高潮，納米顆粒能否損傷肺組織也激起了熱烈的討論。
　　 納米SiO2作為納米材料家族中的重要一員，是目前世界上大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)量最高的一種納米粉體材料，其產(chǎn)品己廣泛應用于電子封裝材料、高分子復合材料、塑料、涂料、橡膠改性、顏料、陶瓷、膠粘劑、玻

3、璃鋼、藥物與基因傳遞復合載體、生物傳感器、化妝品及抗菌材料等幾乎涉及微米SiO2粉體的所有領域。隨著納米SiO2應用領域的拓寬，研究者、生產(chǎn)者和消費者經(jīng)呼吸道、口和皮膚等途徑接觸的機會和水平不斷增加。因其生物安全性尚不確定，所以該方面的研究也是各國學者、有關管理部門及社會公眾的廣泛關注的熱點。
　　 眾所周知以石英為代表的微米SiO2是典型的肺毒物，可引起矽肺和肺癌。在我國已有累計超過60萬的矽肺病人，每年還在以新發(fā)1萬多例的病

4、例數(shù)增長，與之有相同化學組分的納米SiO2是否具有與石英一樣的毒性?為避免重蹈微米SiO2嚴重危害勞動者健康的覆轍，開展納米SiO2的肺毒性研究將十分必要。
　　 本研究以微米SiO2為陽性對照，通過體外培養(yǎng)巨噬細胞染塵及體內經(jīng)氣管灌注大鼠染塵的方法，從細胞和整體動物兩個水平研究納米SiO2的肺毒性作用并探討其機制，為充分認識和評價納米SiO2的安全性、科學生產(chǎn)和應用及今后制訂防護標準等諸多方面提供基礎毒理學資料。實驗結果如下：

5、
　　 1．應用MTT法測定納米和微米SiO2粒子對RAW264.7細胞染毒24h的IC50分別為5.08mg/m1和16.69mg/ml;納米和微米SiO2在31.25～8000μg/ml劑量范圍內，對RAW264.7細胞染毒8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h和72h后，細胞活力降低，呈現(xiàn)劑量和時間-效應關系，500、2000、8000μg/ml納米SiO2染毒組細胞的生長曲線較同劑量微米SiO2降低

6、得更早、更明顯，RT-CES系統(tǒng)和MTT法在評定細胞毒性方面具有較好的一致性；光學和熒光顯微鏡下觀察到500μg/ml納米及微米SiO2可致貼壁細胞數(shù)量減少、體積增大、呈氣球樣變，納米SiO2染毒后，貼壁細胞數(shù)量減少更明顯，細胞形態(tài)趨于不規(guī)則形，部分細胞開始崩解。透射電鏡下觀察到微米SiO2粒子染毒RAW264.7細胞內線粒體腫脹、嵴斷裂、胞質內空泡增多，納米SiO2引起上述細胞超微結構異常改變的程度較微米SiO2重，且細胞染色質固縮，

7、細胞核呈致密濃染。能譜儀分析顯示染毒細胞超微結構中吞噬泡內的顆粒和細胞間隙的顆粒均含有Si元素。
　　 利用丙酮酸法測定125、250、500μg/ml納米及微米SiO2染毒RAW264.7細胞培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高，呈時間-效應關系，三個劑量的納米SiO2染毒組RAW264.7細胞培養(yǎng)液中LDH含量高于微米SiO2(P＜0.05);應用FRAP技術，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡檢測125、500μg/ml納米SiO2與500μg

8、/ml微米SiO2組細胞膜熒光恢復率及細胞膜擴散系數(shù)低于陰性對照組，500μg/ml納米SiO2組及微米SiO2組的細胞膜熒光恢復率和細胞膜擴散系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義；經(jīng)Ca2+敏感探針Fluo-3/AM與激光掃描共聚焦顯微鏡結合檢測125、500μg/ml納米SiO2組與500μg/ml微米SiO2細胞內[Ca2+]j含量在100s、200s、300s、400s、500s和600s的各作用時間點均高于陰性對照組，500μg/ml納米Si

9、O2組及微米SiO2組的細胞內[Ca2+]i含量差異無統(tǒng)計學意義；500μg/ml納米與微米SiO2染毒RAW264.724h用Hoechst33258熒光染色和Annexin V-PI雙染法均可見調亡細胞，125、500μg/ml納米SiO2及500μg/ml微米SiO2粒子致RAW264.7細胞凋亡率高于陰性對照組；運用PI染色流式細胞儀測定125μg/ml納米SiO2粒子致細胞增殖指數(shù)降低及G0/G1期細胞增多，500μg/ml納

10、米SiO2粒子及微米SiO2致細胞增殖指數(shù)降低及G0/G1期、S期細胞增多，500μg/ml納米SiO2組及微米SiO2組細胞凋亡、細胞增殖指數(shù)及各周期分布情況差異無統(tǒng)計學意義；細胞內脂質過氧化測定結果顯示，500μg/ml納米SiO2粒子及微米SiO2染毒細胞內MDA，H2O2，·OH，O2·ˉ，NO水平顯著升高，納米SiO2染毒細胞O2·水平高于微米SiO2;DCFH-DA熒光探針與激光掃描共聚焦顯微鏡結合測定125μg/ml、50

11、0μg/ml納米SiO2及500μg/ml微米SiO2可致細胞內ROS水平升高，呈現(xiàn)時間-效應關系，500μg/ml納米SiO2組所致細胞內ROS水平高于同劑量微米SiO2組。提示與微米SiO2化學組成相同的納米SiO2具有與其相似的細胞毒性作用，由于粒徑小，表面大量羥自由基的存在，作用于巨噬細胞后引發(fā)呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量ROS，參與細胞膜的脂質過氧化反應，產(chǎn)生大量自由基，這些自由基以各種方式攻擊細胞膜，導致細胞膜流動性下降，細胞膜對LD

12、H的通透性增高，細胞內外離子交換障礙，細胞內鈣超載，細胞發(fā)生凋亡，增殖周期出現(xiàn)異常，從而引起細胞損傷，納米SiO2的細胞毒性較微米SiO2強。
　　 2.125μg/ml、500μg/ml納米SiO2及500μg/ml微米SiO2可致RAW264.7細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、TGF-β1及IL-1β的生成量增加，500μg/ml納米SiO2與微米SiO2致上述細胞因子生成量無差別，500μg/ml納米SiO2組MMP-2陽性表

13、達率高于同濃度微米SiO2組；RAW264.7細胞在以上濃度納米SiO2及微米SiO2染毒24h后，培養(yǎng)上清液誘導CHL細胞增殖率、產(chǎn)生羥脯氨酸的量及MMP-2陽性表達率較陰性對照組增加，500μg/ml納米SiO2組的CHL細胞增殖率與相同濃度微米SiO2組無差別，而產(chǎn)生羥脯氨酸的含量及MMP-2陽性表達率高于相同濃度微米SiO2組；隨納米SiO2染毒濃度的增加，RAW264.7細胞生成細胞因子TNF-α、TGF-β1及IL-1β的量

14、及CHL細胞增殖率、生成羥脯氨酸的量、MMP-2陽性表達率升高。說明納米SiO2在介導AMs方面具有與微米SiO2一樣的作用，即激活AMs，通過細胞因子網(wǎng)絡使FB增殖及膠原合成與分泌增加，同時促進CHL細胞MMP-2高表達，不斷降解細胞外基質，參與肺泡基底膜損傷，從而啟動肺組織纖維化的發(fā)生。
　　 3．采用一次性氣管灌注方式，以50mg/ml的劑量對雄性Wistar大鼠進行納米和微米SiO2灌注1ml染塵，24h內納米SiO2染

15、塵組大鼠因肺水腫而陸續(xù)死亡，而微米SiO2在急性毒性的觀察期7天內未見異常反應，故本實驗以25mg/ml為最高劑量一次灌注大鼠1ml，染塵30天后發(fā)現(xiàn)25mg/ml微米和納米SiO2組雙肺腫大，肺組織臟器系數(shù)較對照組及6.25、12.5mg/ml的納米SiO2組增加，25mg/ml納米SiO2組大鼠肺組織臟器系數(shù)高于對照組但低于同濃度微米SiO2組；25mg/ml微米SiO2染塵組大鼠出現(xiàn)肺組織正常結構破壞，炎性細胞輕度浸潤，細胞性結節(jié)

16、形成、膠原纖維增多的病理改變，25mg/ml納米SiO2染塵組大鼠未形成明顯結節(jié)，病理改變較微米SiO2組輕微；25mg/ml微米和納米SiO2染塵大鼠肺組織超微結構表現(xiàn)出Ⅱ型肺泡上皮細胞增殖，排出嗜鋨板層小體，肺泡巨噬細胞大量增生、吞噬塵粒、脂質和嗜鋨小體的改變；透射電鏡和能譜儀結合檢測發(fā)現(xiàn)灌肺后24h內微米SiO2染塵組大鼠尿液中有少量粒子排出，而納米SiO2染塵組大鼠尿液中有大量粒子排出；6.25、12.5、25mg/ml納米Si

17、O2及25mg/ml微米SiO2染塵組大鼠肺組織MDA生成量及MMP-2表達量增加，12.5、25mg/ml納米SiO2及25mg/ml微米SiO2染塵組大鼠肺組織NO、羥脯氨酸生成量增加，25mg/ml微米SiO2組NO、羥脯氨酸的生成量及TNF-α、IL-1β及MMP-2的表達量高于同濃度納米SiO2組；流式細胞儀測定12.5、25mg/ml納米SiO2及25mg/ml微米SiO2組肺細胞凋亡率增加，25mg/ml微米SiO2組肺細

18、胞凋亡率高于同濃度納米SiO2組，6.25、12.5、25mg/ml納米SiO2及25mg/ml微米SiO2致G1期細胞增多，S期、G2/M期及細胞增殖指數(shù)降低，25mg/ml微米SiO2組G1期、S期細胞及細胞增殖指數(shù)高于同濃度納米SiO2組。提示納米SiO2經(jīng)呼吸道進入肺部后，與微米SiO2一樣，在AMs脂質過氧化反應的介導和釋放TNF-α、TGF-β1、IL-1β等細胞因子的調節(jié)下，導致肺部炎癥、肺泡損傷及膠原代謝紊亂，細胞外基質

19、沉積，從而導致肺纖維化。
　　 以上結果提示在體外細胞毒性實驗中，納米SiO2粒子與微米SiO2一樣可通過誘導脂質過氧化作用引起細胞形態(tài)和超微結構改變、細胞膜流動性下降及通透性升高、細胞內游離Ca2+水平增高，細胞凋亡率增高，細胞周期異常，從而使體外培養(yǎng)RAW264.7細胞的生長受到抑制、結構和功能受到損傷；納米SiO2刺激RAW264.7細胞的培養(yǎng)上清可致細胞因子TGF-β1、IL-1β和基質金屬蛋白酶MMP-2釋放量增加，由

20、此促進CHL細胞增生，膠原合成增多，具有潛在的致纖維化作用。其細胞毒性納米SiO2高于微米SiO2。整體動物實驗結果提示，納米SiO2也可通過誘導經(jīng)呼吸道染塵大鼠肺組織脂質過氧化作用增強，介導細胞因子TNF-α、TGF-β1、IL-1β和基質金屬蛋白酶MMP-2表達增加以及肺細胞凋亡率增加、細胞周期改變，引發(fā)肺組織損傷，導致肺臟器系數(shù)增加、肉芽腫結節(jié)形成、肺組織內羥脯氨酸含量增高，發(fā)生纖維化，但由于納米SiO2粒子粒徑小，易于擴散進入肺