糙皮側耳栽培種EST--SSR標記應用及初級核心種質庫的構建.pdf

1、DevelopmentofESTSSRMarkersinConstructionofPrimaryCoreCollectionThe“submittedt01laeslsSUmlttetodaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof—MasterofScienceZhangXue—mei(CollegeofLifeSciences)Supervi

2、sor：GongZhiyuanSongAirongQingdaoChinaJune，2012摘要糙皮側耳(Pleurotusostreatus)是我國食用菌的主要栽培品種之一，但因其菌株名稱混亂，同名異物、同物異名現象嚴重，一定程度上阻礙了食用茵產業(yè)的發(fā)展，因此需要一種快速、簡便、穩(wěn)定的鑒別分類方法。本文搜集整理了國內外糙皮側耳栽培種的種質資源庫，結合農藝學性狀和ESTSSR分子標記技術構建了糙皮側耳栽培種初級核心種質庫j并初步進行了核

3、心種質庫的DNA指紋圖譜分析。從國內外糙皮側耳栽培的主產區(qū)搜集整理栽培種共299株，通過品種栽培試驗初步排除同種異名，結合來源地與栽培學農藝性狀進行分區(qū)，根據菌絲生物學特性及子實體長勢從中隨機取樣選出185株用于構建初級核心種質庫。通過搜索、剪切和重組NCBI等數據庫公布的側耳、靈芝、香菇的EST序列，用Primer50軟件開發(fā)出9條側耳ESTSSR引物，58條靈芝ESTSSR引物，35條香菇ESTSSR引物。通過優(yōu)化試驗確定PCR反應

4、體系為(25gL)：10x緩沖液25此，25mmol的dNTPs20gL，25UgL’1Taq酶025灶L，10gML。的正反向引物各10皿，模板50～100ng；PCR反應程序為：94。C預變性5min；94℃變性30s；50～65。C復性45s；72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min；產物用2％的瓊脂糖凝膠(含溴乙錠05gg／mL)電泳檢測。對靈芝引物和香菇引物在糙皮側耳上進行了通用性研究：隨機選取5株糙皮側耳菌株對1

5、02對引物進行初篩，篩選出16對能擴增出條帶的引物，占27％；6對香菇引物能擴增出條帶，占l7％；進一步在16個糙皮側耳菌株上對靈芝的16對引物和香菇的6對引物進行復篩，其中4對靈芝引物和2對香菇引物能擴增出穩(wěn)定、清晰且多態(tài)性好的帶型。重復試驗選出4條多態(tài)性好、條帶清晰的引物，對選取的185株糙皮側耳栽培種進行擴增分析：共擴增得到59條帶，每個引物擴增條帶數為12—19條，擴增片段在100～1100bp之間；根據擴增結果采用符合系數計算

6、個體間的相似距離，用不加權類平均法(UPGMA)進行系統聚類；根據計算各位點等位基因的頻率，確定各位點最低和最高頻率的等位基因，優(yōu)先選取具有這些稀有等位基因的個體作為核心材料；對于剩余的材料采用多次聚類隨機取樣法抽取核心種質，最終構建了一個含47株糙皮側耳栽培種的初級核心種質庫Pcore47。經分析得到：Pcore47占原群體樣品數25％，占資源庫的13％；有效等位基因數和多態(tài)性位點占有率與原群體一致，多樣性指數均值比原群體高01274