斑蝥素提取、特異性抗體的制備及其酶聯(lián)免疫檢測方法的研究.pdf

1、斑蝥素（cantharidin），是中藥材斑蝥的有效成分，屬于倍半萜烯類天然防御性毒素，由于其獨特的抗癌性，人們在其抗癌機制以及毒理藥理上進行了大量的研究，并合成了大量的斑蝥素衍生物。但是，仍然在斑蝥素的生物合成位點、合成途徑已經(jīng)斑蝥素的抗癌機制上存在許多疑難問題。
　　目前，斑蝥素的檢測方法有重量法、酸堿法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜法等，但這些方法通常需要昂貴的色譜儀器，有的還必須事先對樣品進行繁雜的純化處理，而

2、且對操作人員的技術(shù)要求很高。
　　然而，隨著免疫學的發(fā)展，酶聯(lián)免疫檢測方法不再僅僅局限于大分子的檢測，而是日益廣泛的被用于小分子物質(zhì)的檢測。雖然小分子物資在結(jié)構(gòu)上不具有抗原性，但是通過與大分子物質(zhì)偶聯(lián)后便具有了抗原的免疫原性和免疫反應性。進而，就可以構(gòu)建小分子的酶免疫檢測方法了。
　　研究目的：從斑蝥體內(nèi)提取斑蝥素，以此合成斑蝥素羧基衍生物 N-羧乙基斑蝥酰亞胺，探究合成反應最佳條件及產(chǎn)率并比較二者的毒性；通過斑蝥素和β-丙

3、氨酸合成半抗原N-羧乙基斑蝥酰亞胺，并借助半抗原的偶聯(lián)來制備人工完全抗原，免疫兔子獲得特異性抗體，最終根據(jù)抗原抗體反應原理建立斑蝥素間接競爭ELISA檢測方法及其檢測曲線。
　　研究方法：以混合提取法、震蕩提取法及快速提取法等方法分別提取斑蝥素，并進行比較；在單因素不同的體系中斑蝥素與β-丙氨酸進行縮合反應，且用GC、TLC、UV、MS、NMR等對提取物及反應產(chǎn)物進行鑒定，并通過改良寇氏法測定斑蝥素及其衍生物的LD50以比較其胃毒

4、毒性；以NHS酯法用偶聯(lián)劑DCC、NHS將半抗原 N-羧乙基斑蝥酰亞胺偶聯(lián)到載體蛋白上，用摩爾吸光系數(shù)法進行檢測確認偶聯(lián)成功后，用斑蝥素人工完全抗原免疫兔子；ELISA方法檢測抗體效價達到1：3200后分離血清，并用CNBr活化的瓊脂糖凝膠4B親和層析對抗血清中的進行純化，對于純化的結(jié)果借用SDS-PAGE以及ELISA方法進行檢測；將純化的斑蝥素特異性抗體及斑蝥素人工完全抗原采用間接競爭法構(gòu)建斑蝥素間接競爭ELISA檢測方法，并建立檢

5、測曲線，探討該檢測曲線的檢測范圍及其極限，用GC法來驗證蝥素間接競爭ELISA檢測方法在檢測斑蝥粗提物斑蝥素的含量中的準確性與可靠性。
　　研究結(jié)果：混合提取法得到的斑蝥素純度達98.53％，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定可以確認縮合產(chǎn)物為N-羧乙基斑蝥酰亞胺；縮合反應的最佳反應條件：n（斑蝥素）/n（β-丙氨酸）=1/1.2；媒介溶劑與催化劑均為Et3N，最佳用量為1 mol的斑蝥素需72 ml的Et3N，125～150℃下脫水反應4～5 h，產(chǎn)率

6、可達74.40%。衍生物對小鼠的胃毒性僅為斑蝥素毒性的1/400；經(jīng)過鑒定，采取 NHS酯法得到的人工完全抗原中半抗原N-羧乙基斑蝥酰亞胺與載體蛋白BSA、OVA的結(jié)合比分別為25:1、23:1；兔抗血清的效價在純化之前為1:3200，純化后達到1:6400～1:12800，為純化前的2～4倍；斑蝥素間接接競爭ELISA檢測方法及其測定曲線為y=-0.0697x+0.1894，該曲線的檢測范圍是2.4 mg/ml～2.4 mg/L，并且