5-HETE引起人白血病K562細胞凋亡及其信號轉(zhuǎn)導機制的研究.pdf

1、研究主要從細胞形態(tài)學、流式細胞半定量及5-HETE對K562細胞損傷中細胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡基因改變等方面,考察了5-HETE對K562細胞引起的凋亡作用;觀察5-HETE引起凋亡作用時K562細胞對酪氨酸磷酸化、MAPK途徑中ERK磷酸化及P38 MAPK磷酸化等的變化;并應用酶氨酸蛋白激酶抑制劑genestein、P38 MAPK抑制劑SB2035809和MEK抑制劑PD098059觀察5-HETE對K562細胞在磷酸化途徑及MAPK

2、途徑上的作用,試圖闡明5-HETE通過MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑引起K562細胞凋亡的機制.該研究主要結(jié)果如下:1.5-HETE引起白血病K562細胞的凋亡:1.1采用四唑鹽比色法測定5-HETE對K562細胞損傷時間在3h~24h之間、濃度在0.1~0.5μM、損傷時間為12h時能引起K562細胞損傷.1.2電鏡觀察損傷的形態(tài)學改變:與無5-HETE處理組對照,在5-HETE刺激下,K562呈現(xiàn)出典型的凋亡特征:細胞表面微絨毛消失,細胞質(zhì)濃

3、縮,細胞核變小,核染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)成塊,出現(xiàn)染色質(zhì)質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列的核著邊現(xiàn)象,呈半月形凝集在核膜周邊.1.3利用流式細胞儀進行定量分析發(fā)現(xiàn),對照組細胞凋亡率為6％,而5-HETE損傷組的細胞凋亡率上升到22％,與對照組相比有顯著性差異.1.4RT-PCR分析5-HETE引起K562細胞凋亡時,細胞內(nèi)促凋亡基因和抗凋亡基因的改變.2.5-HETE引起K562細胞凋亡的MAPK途徑研究:2.1 5-HETE對酪氨酸磷酸化的作用:與空白相比

4、,在加入5-HETE 1min、5min、10min、30minT 60min時,酪氨酸磷酸蛋白的表達在1min~10min呈時間依賴性地減少,在10min時達到最低;2.2 5-HETE對ERK磷酸化的作用:在加入5-HETE 1min、5min、10min、30minT 60min時,ERK磷酸化蛋白的表達呈時間依賴性地減少;在ERK磷酸化的長時間作用中,5-HETE損傷組在24h時蛋白的表達量最低;2.3 5-HETE對P38磷酸

5、化的作用:與空白組相比,在加入5-HETE 1min、5min、10min、30minT 60min時,30min蛋白的表達量最低;3.應用酪氨酸激酶抑制劑genestein、P38 MAPK抑制劑SB2035809和MEK抑制劑PD098059,分別觀察對5-HETE引起K562凋亡作用的影響:3.1 5-HETE損傷組引起K562細胞細胞色素C釋放增加、caspase 3、8和釋放增加;3.2 應用P38 MAPK 抑制劑SB203

6、580時,與5-HETE損傷組相比,抗凋亡基因bcl-2的表達增加、caspase家族中caspase3和caspase9的表達減少;3.3 應用MEK抑制劑PD098059,與5-HETE損傷組相比,抗凋亡基因bcl-2的表達增加,caspase3的表達沒有顯著差異.3.4 應用酪氨激酶抑制劑genstein的處理組中,細胞色素C的釋放與5-HETE損傷組相比顯著減少caspase3、caspase8和caspase9的表達與5-HE

7、TE損傷組沒有顯著性差異.3.5 三種抑制劑能分別對抗5-HETE引起的K562細胞存活率的降低;以上實驗結(jié)果表明:5-HETE在白血病K562細胞的凋亡中起著重要作用.根據(jù)這些結(jié)果,我們認為5-HETE通過減少酪氨酸磷酸化及MAPK途徑中P38磷酸化、ERK磷酸化作用,激活細胞色素C自線粒體釋放至胞質(zhì),促使胞質(zhì)細胞色素C對caspase蛋白酶的激活從而導致K562細胞凋亡.作為酪氨酸激酶抑制劑的genestein、P38 MAPK抑制