凋亡抑制基因Survivin在胃癌中異常表達機制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述:
　　第一部分
　　目的:
　　1.通過優(yōu)化反應體系,建立SYBR GreenⅠ染料real-time PCR檢測Survivin基因的方法。
　　2.驗證二次導數最大值(SDM)法確定Ct值在實時定量熒光PCR中的應用價值。
　　方法:
　　1.根據PCR產物熒光強度、循環(huán)閾值(Ct值)、標準曲線斜率、相關系數和熔解曲線優(yōu)化反應體系中各組分的量及反應條件,并對引物二聚

2、體消除策略和Ct值獲取方式進行評價。
　　2.根據SDM法確定Ct值不受熒光曲線基線影響的特性,建立一種不需核酸抽提步驟而直接利用血清快速定量檢測血清中乙肝DNA的實時熒光PCR方法,用于驗證其效能。由于蛋白質,膽紅素、血紅蛋白和甘油三酯等不可避免地存在于血清中,可能對檢測產生干擾,因此按EP7-P方案對其進行了抗干擾評價。
　　結果:
　　1.SYBR GreenⅠ實時定量熒光PCR體系擴增Survivin的最佳組成

3、和條件是:Taq酶2.5U/100μl、MgCl22mmol/L、引物濃度0.2μmol/L和退火溫度58℃;在PCR循環(huán)延伸結束后設置一個低于特異產物Tm值2℃的熒光讀取溫度,能有效消除引物二聚體對定量檢測的影響。研究建立的SYBR GreenⅠ染料實時定量PCR檢測Survivin基因劑量方法的靈敏度為10拷貝/μl,線性范圍101~104拷貝/μl(r=0.9997),批內變異系數(CV)1.13％~1.91%,批間CV3.31%

4、~4.50%。
　　2.在實時熒光PCR檢測系統采用SDM法確定Ct值,不僅能克服了主觀因素所致重復性差的問題,同時還能在多種基質效應和熒光干擾物存在的情況下保證定量檢測結果的可靠性,應被當作實時熒光定量PCR確定Ct值的首選方法。
　　結論:
　　1.優(yōu)化后的SYBR GreenⅠreal-time PCR具有方便、經濟、靈敏度較高和重復好等特性,適合于做Survivin基因劑量分析。
　　2.SDM法確定Ct

5、值法明顯優(yōu)于手工閾值法,適合于實時熒光PCR檢測。
　　第二部分
　　目的:
　　1.研究Survivin及其選擇性剪接變異體在胃癌中的表達及意義。
　　2.探討胃癌Survivin基因擴增與表達以及臨床病理參數之間的關系。
　　3.建立限制性內切酶依賴的SYBR GreenⅠ實時熒光PCR方法,檢測胃癌組織Survivin外顯子1去甲基化狀態(tài),研究其與Survivin mRNA表達以及臨床病理參數之間的關

6、系。
　　4.探討Survivin基因啟動子區(qū)域-31G→C多態(tài)性與胃癌發(fā)生及Survivin mRNA表達的關系。
　　方法:
　　1.建立SYBR GreenⅠ實時熒光RT-PCR方法,結合免疫組織化學技術,對Survivin各種剪接變異體在胃癌及癌旁組織中的表達情況進行檢測,同時還對Survivin各種剪接變異體表達水平和臨床病理資料作相關性分析。
　　2.建立一種實時熒光定量PCR檢測Survivin基因

7、的方法,Survivin基因和內參β2-MG基因的絕對含量通過參考DNA的標準曲線獲得,以目的基因拷貝與看家基因拷貝數比值計算目的基因的相對拷貝數,以腫瘤組織DNA相對拷貝數與正常組織DNA相對拷貝數比值>2.0判斷為腫瘤目的基因擴增。
　　3.25例胃癌及與其配對的正常胃組織DNA經甲基化敏感性限制性內切酶HpaⅡ和MspⅠ處理后用SYBR GreenⅠ實時熒光PCR對Survivin外顯子1進行檢測,Survivin mRNA

8、的表達水平采用實時熒光定量PCR的方法進行檢測。
　　4.采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析技術(PCR-RFLP)檢測Survivin基因多態(tài)性,同時用實時熒光RT-PCR對腫瘤組織的Survivin mRNA進行定量檢測。
　　結果:
　　1.癌組織和癌旁組織均表達Survivin,并且得到免疫組織化學的證實;Survivin-2B主要表達于癌旁組織,而Survivin-△EX3則主要在癌組織中被檢出;Su

9、rvivin-3B偶見于癌組織和癌旁組織中;Survivin-2a在癌組織和癌旁組織中的陽性率為100%,但并不伴隨著Survivin在癌組織中升高。經相關分析,Survivin-2a與總Survivin高度正相關(rs=0.4178,P=0.0018),而與Survivin-△EX3高度負相關(rs=-0.4506,P=0.0007),提示Survivin-2a可能作為非凋亡抑制因子,在腫瘤組織中對抗凋亡抑制因子。
　　2.胃癌

10、組織中Survivin基因的擴增率為13.9%(6/43),擴增倍數一般在2-10不等,發(fā)生擴增的6例均高表達Survivin mRNA;腫塊≥5cm的胃癌組織Survivin基因擴增率為33.3%,明顯高于腫塊<5cm的胃癌組織(6.5%的擴增率),具有顯著差異(P﹤0.05);胃癌組織中Survivin基因擴增與患者年齡、病理類型、淋巴轉移和臨床分期無相關性。
　　3.Survivin外顯子1去甲基化率在胃癌組織和癌旁組織分別

11、為96.0%(24/25)和20.0%(5/25)(2=29.639,p<0.001)。在25例胃癌組織中有22例(88.0%)發(fā)生Survivin mRNA過表達,并且表達與去甲基化呈正相關(rs=0.5528,P=0.00416)。沒有發(fā)現去甲基化與年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、臨床分期和轉移與否等病理參數之間存在統計學上的相關性(P>0.05)。
　　4.胃癌Survivin-31位C/C基因型頻率顯著高于對照組(基因頻率

12、0.396對0.119,2=18.89,P<0.005),-31C等位基因頻率也顯著高于對照組(等位基因頻率0.594對0.328,2=7.498,P<0.005)。胃癌組織高表達Survivin mRNA,但未發(fā)現Survivin-31基因型與Survivin mRNA表達之間的相關性。
　　結論:
　　1.Survivin不同變體表達之間的平衡關系可能對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起重要作用,其檢測對腫瘤早期診斷和腫瘤性質判斷有一定