RNA干擾沉默CRBP-1基因表達抗肝纖維化的實驗研究.pdf

1、本研究分為以下三部分： 第一部分：大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒載體的構建與鑒定 目的：構建和鑒定大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒載體。 方法：針對篩選確定的大鼠CRBP-1基因RNA干擾(RNAi)有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成雙鏈DNA，與經HpaI和XhoI酶切后的pGCL-GFP載體連接產生shRNA慢病毒載體，命名為Lv-shCRBP-1，PCR篩選陽性克隆，測序鑒定。再將

2、Lv-shCRBP-1轉染大鼠原代HSCs，采用RealtimePCR的方法檢測CRBP-1的mRNA表達。 結果：PCR鑒定與DNA測序證實合成的Lv-shCRBP-1寡核苷酸鏈插入正確。Lv-shCRBP-1在大鼠HSCs上對CRBP-1基因有顯著的敲減作用。 結論：成功構建大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒載體。 第二部分：慢病毒介導的CRBP-1基因RNAi對大鼠HSC生物學特性的影響 目的：研

3、究慢病毒介導的CRBP-1基因RNAi對大鼠HSC生物學特性的影響。 方法：表達CRBP-1shRNA慢病毒載Lv-shCRBP-1在體外轉染HSCs，應用RealtimePCR檢測CRBP-1、α-SMA、Collagen-1、MMP3、TIMP1/2等基因的表達情況，Westernblot技術檢測α-SMA、Collagen-1蛋白的表達。 結果：1)Lv-shCRBP-1在轉染HSCs后CRBP-1、α-SMA、C

4、ollagen-1mRNA的表達下調，MMP13、TIMP1/2mRNA的表達上調。2)Lv-shCRBP-1在轉染HSCs后CRBP-1和α-SMA的蛋白合成下降。 結論：Lv-shCRBP-1可以有效地抑制HSCs中CRBP-1和α-SMA的mRNA表達及蛋白合成，同時使Collagen-1mRNA的表達下調，MMPB、TIMP1/2的mRNA表達上調，使HSCs細胞外基質分泌下降。 第三部分：慢病毒介導的CRBP-

5、1基因RNAi對大鼠肝纖維化發(fā)展的影響 目的：在大鼠體內探討慢病毒介導的CRBP-1基因RNAi對抗肝纖維的作用。 方法：在CCl4誘導的肝纖維化模型中，在注射CCl4的前1周，經門靜脈注射Lv-shCRBP-1轉染大鼠肝臟，CCl4注射的第4周處死大鼠，摘取肝臟，應用實時定量PCR檢測肝臟中CRBP-1、α-SMA、Collagen-1基因的表達，檢測肝臟組織中羥脯氨酸(Hyp)的含量，同時取大鼠肝臟行組織學檢查。

6、 結果：Lv-shCRBP-1轉染肝臟組織中，顯著降低CRBP-1、α-SMA、Collagen-1的表達，Hyp含量顯著下降，肝臟的組織學變化改善，表現(xiàn)為肝小葉結構紊亂減輕，纖維間隔變薄，匯管區(qū)炎癥細胞浸潤減少。 結論：Lv-shCRBP-1可通過抑制肝臟組織中CRBP-1的表達，從而抑肝臟組織中Collagen-1和α-SMA等基因的表達，改善肝功能并減輕肝纖維化程度。 本實驗成功成功構建大鼠CRBP-1基因sh