脊索細(xì)胞與椎間盤退變的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分：兔腰椎間盤退變模型建立
　　 目的：纖維環(huán)損傷誘導(dǎo)椎間盤退變建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
　　 方法：新西蘭大白兔12只年齡2歲左右，體重2.0-3.5KG左右，雌雄不限。2只作為正常對(duì)照未行手術(shù)，其余10只進(jìn)行手術(shù)制造椎間盤退變模型。
　　 手術(shù)采用10％水合氯醛3ml/kg耳緣靜脈注射麻醉、備皮、碘伏消毒、鋪巾。采用腰椎背側(cè)縱切口，椎旁肌腹側(cè)2cm，從胸廓下緣2cm至骨盆環(huán)，脊柱L1-L6左前外側(cè)被暴露，鈍性

2、分離椎前軟組織，骨盆環(huán)作為L(zhǎng)5/6間隙的標(biāo)志。用18G針頭分別在L2/3、L4/5椎間盤進(jìn)行穿刺，L3/4和L5/6作為自身對(duì)照。術(shù)后2、4、8、16、32周各隨機(jī)選取2只兔，行脊柱MRI檢查并行免疫組化及組織學(xué)觀察。結(jié)果：術(shù)后第3----10周造模后的椎間盤MRIT2WI信號(hào)呈現(xiàn)持續(xù)減弱趨勢(shì)，而內(nèi)對(duì)照非手術(shù)節(jié)段髓核信號(hào)強(qiáng)度在觀察期內(nèi)無(wú)明顯變化。各組椎間盤分級(jí)分值的變化顯示，從術(shù)后2周開始，穿刺椎間隙與自身內(nèi)對(duì)照椎間隙比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)

3、意義(P<0.05)；穿刺髓核MRIT2相信號(hào)呈進(jìn)行性下降，至術(shù)后16周呈快速下降。免疫組化及組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞的數(shù)量及II型膠原含量較對(duì)照間盤進(jìn)行性減少(P<0.01)。
　　 結(jié)論：纖維環(huán)穿刺誘導(dǎo)兔椎間盤退變的動(dòng)物模型能再現(xiàn)IDD發(fā)展的客觀規(guī)律而且模型制作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。
　　 第二部分：不同年齡組兔推間盤細(xì)胞分布類型研究
　　 目的：分析脊索細(xì)胞和軟骨樣細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)及隨年齡增長(zhǎng)時(shí)的分布情況
　　

4、 方法：取3月齡組和3年齡組新西蘭大白兔各5只，完整取出腰椎脊柱．兔腰椎椎間盤纖維環(huán)橫行切開，完整取出髓核，放入petri培養(yǎng)皿，PPS洗液調(diào)制PH7.21％低熔點(diǎn)的瓊脂糖覆蓋，覆蓋、固走組織，然后植入10％的中性福爾馬林中固定，對(duì)于髓核和纖維環(huán)邊緣不清的三度退變椎間盤，用6mm直徑的穿刺針取出椎間盤中央部分，瓊脂糖包埋的髓核。熒光抗淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下測(cè)量細(xì)胞大小以及CD44和vimentin在脊索細(xì)胞和軟骨樣髓核細(xì)胞內(nèi)

5、表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度。
　　 結(jié)果：應(yīng)用共聚焦顯微鏡，可以在新西蘭大白兔椎間盤髓核標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞：脊索細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。兩種細(xì)胞在大小上有明顯的區(qū)別，在3月齡新西蘭大白兔的椎間盤中，脊索細(xì)胞占主要部分。從細(xì)胞計(jì)數(shù)上分析，脊索細(xì)胞占全部的80.92％，與軟骨樣髓核細(xì)胞數(shù)量有著明顯的差異：在3年組新西蘭大白兔的椎間盤中，軟骨樣髓核細(xì)胞占主要部分，而脊索細(xì)胞數(shù)量較3月組明顯減少，比例為32.8％，表明脊索細(xì)胞數(shù)量隨年齡的增長(zhǎng)而遞減，

6、軟骨樣髓核細(xì)胞的數(shù)量隨年齡遞增。Vimentin和CD44平均熒光強(qiáng)度在脊索鈿胞內(nèi)陰顯高于軟骨樣髓核細(xì)胞，兩者相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：脊索細(xì)胞內(nèi)這兩種蛋白的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于軟骨樣髓核細(xì)胞(P<0.01)且與年齡呈負(fù)相關(guān)，年齡越小，表達(dá)越強(qiáng)。提示隨著脊索細(xì)胞成熟和老化，與脊索細(xì)胞調(diào)控和發(fā)揮功能相關(guān)的蛋白表達(dá)量逐漸下降。其對(duì)周圍環(huán)境發(fā)揮作用亦逐漸減少。
　　 第三部分：脊索細(xì)胞在兔椎間盤退變過(guò)程中的作用和轉(zhuǎn)歸

7、r>　　 目的：對(duì)脊索細(xì)胞在椎間盤退變過(guò)程中的作用的研究
　　 方法：新西蘭大白兔28只，分3月齡和3年齡兩組，每組共14只，3月齡組體重1.5±2.0kg，3年齡組體重3.0-4.5kg左右，雌雄不限。每組中有2只作為正常對(duì)照未行手術(shù)。每組其余12只進(jìn)入手術(shù)制造椎間盤退變模型。術(shù)后2，4，8，16，24周行MRI影像學(xué)確認(rèn)椎間盤退變后，經(jīng)耳緣靜脈注入空氣10mL處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，獲取手術(shù)節(jié)段和正常自身對(duì)照的椎間盤髓核組織，手術(shù)節(jié)

8、段髓核作為退變組，自身未作處理間隙作為對(duì)照組。取下的髓核組織分成兩部分，一部分行免疫組織切片后進(jìn)行HE染色與aggrecan，II型膠原和PCNA染色，免疫組織化學(xué)染色觀察。另一部分-70度保存，RT-PCR檢測(cè)。
　　 結(jié)果：椎間盤退變模型顯示脊索細(xì)胞逐漸消失，被軟骨樣髓核細(xì)胞和不規(guī)則的基質(zhì)取代，3月組兔椎間盤退變模型，前16周脊索細(xì)胞PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率基本保持穩(wěn)定，16周后顯著減少，軟骨樣髓核細(xì)胞的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率

9、16周后逐漸增多。3年組脊索細(xì)胞PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率前8周逐漸增高，后逐漸下降；軟骨樣髓核細(xì)胞PCNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞率前4周基本保持穩(wěn)定，8周后逐漸增高。
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)兩個(gè)年齡組在出現(xiàn)蛋白多糖和II型膠原RT-PCR水平下降．MRIT2像信號(hào)出現(xiàn)明顯降低后，術(shù)后相同時(shí)間點(diǎn)3月齡組組織學(xué)觀測(cè)較3年組存在較多的脊索細(xì)胞，雖然該細(xì)胞在PCNA和aggrecan蛋白水平表達(dá)兩組無(wú)顯著差異，但髓核細(xì)胞PCNA和aggrecan蛋白水平