CX26致聾突變體的表達、定位和間隙連接功能研究.pdf

1、耳聾是引起交流障礙最常見的疾病。在常染色體隱性遺傳性聾中，約50％以上耳聾是由GJB2(CX26)基因缺陷所致，其中白種人最常見的突變是35del G，東亞人最常見的突變是235delC，該基因突變還與常染色體顯性遺傳性聾和遺傳性綜合征性聾有關，是最重要的耳聾基因。CX26(Connexin26)是間隙連接蛋白家族中的一員。間隙連接通道(Gap Junctional Channels，GJCh)是間隙連接蛋白在相鄰細胞膜上組成的一種細胞

2、膜性通道，能允許離子(ionic coupling，離子耦聯)、或諸如分子量<1000 Da的代謝產物和第二信使分子等小分子物質(biochemical coupling，生化耦聯)交換通過。生物體通過這種通道進行物質和信息交換，使得細胞對內外環(huán)境的刺激作出協調一致的反應，對細胞的新陳代謝、增殖和分化、內環(huán)境穩(wěn)定等生理過程起著重要的調控作用。GJCh的功能分析包括離子耦聯和生化耦聯兩個方面的分析。
　　 目的：探討CX26不同結

3、構域上的各1個點突變(S19T、E47K、V84L、V95M、R165W、R32H、R143W、S199F和L214P)，及導致不同長度截短蛋白的突變(35del G、235delC、572delT、465 T→A(Y155X)和631—632delGT)在體外真核細胞內的表達、定位和間隙連接功能的改變；尤其是對CX26的6個在國際上還沒有功能研究報道的突變(R32H、R165W、S199F、572delT、465T→A和631—632

4、delGT)在體外真核細胞表達載體分析突變蛋白功能的變化。本文中的5個截短蛋白突變的共同點是CX26的羧基端(C端)缺失，5個截短蛋白突變的分析可能反應C端對CX26運輸、定位和間隙連接功能的作用。本研究旨在為分析GJB2基因突變致聾的分子機制、及為防治該基因缺陷所致的耳聾奠定理論基礎。
　　 方法：從CX26的9個結構域各選1個致聾點突變(錯義突變)，及5個導致不同長度截短蛋白的移碼或無義突變，其中包括我國最常見的突變235d

5、elC，高加索人群中最常見的突變35delG，我們以前發(fā)現的一個新突變Y155X，以及572delT和631-632delGT，分別用Overlap法和長引物法快速構建CX26基因的這14個致聾突變體(p.S19T、p.R32H、p.E47K、p.V841L、 p.V95M、p.R143W、p.R165W、p.S199F、p.L214P、c.35delG、c.235delC、p.Y155X、c.572delT和c.631-632delG

6、T)，將各突變體及野生型CX26分別裝入pEGFP-N1質粒。脂質體轉染HeLa細胞，Western印跡分析突變型和野生型CX26在HeLa細胞的表達，熒光顯微鏡下初步觀察CX26突變蛋白和野生型蛋白在HeLa細胞的表達和定位后，進一步用共聚焦顯微鏡觀察CX26突變蛋白和野生型蛋白的定位及在細胞膜上有無間隙連接斑樣結構形成。對無間隙連接斑樣結構形成的突變體，再對轉染的HeLa細胞的高爾基體和內質網染色進行染色標記，共聚焦顯微鏡下觀察突變

7、蛋白是否定位于高爾基體或內質網，了解突變蛋白的亞細胞定位。對能形成間隙連接斑的突變體采用calcein染料轉移實驗分析所形成的間隙連接通道的生化耦聯功能。
　　 結果:通過overlap法成功構建了p.R32H、p.E47K、p.V84L、p.V95M、p.R143W、p.R165W、p.S199F及c.35delG突變體；通過長引物法成功構建了p.S19T、p.L214P、c.235delC、p.Y155X、c.572delT

8、及c.631-632delGT突變體。Western印跡檢測結果顯示，c.35delG突變體在HeLa細胞無突變蛋白的表達，其他13個突變蛋白在HeLa細胞都有表達。p.S19T、p.R32H、p.E47K、p.V84L、p.V95M、p.R143W、p.R165W、p.S199F和p.L214P突變蛋白的分子量大小與野生型CX26基本相同，c.235delC、p.Y155X、c.572delT及c.631-632delGT突變蛋白的分

9、子量小于野生型，為截短蛋白。p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M、p.R165W突變蛋白主要定位在細胞膜上，聚集成間隙連接斑樣結構。p.R32H、p.R143W、p.S199F、p.L214P、c.235delC、p.Y155X、c.572delT、c.631-632delGT突變蛋白在細胞內呈彌散分布，主要定位于內質網，高爾基體染色部位無突變蛋白分布，在細胞膜上觀察不到突變蛋白表達。Calcein染料轉移實驗發(fā)現p.

10、V84L在HeLa細胞上形成的突變蛋白間隙連接和野生型CX26間隙連接具有Calcein染料轉移功能，無顯著性差異。而p.S19T、p.E47K、p.V95M、p.R165W突變蛋白在HeLa細胞形成的間隙連接不能進行calcein染料轉移。
　　 結論：CX26的p.R32H、p.R143W、p.S199F和p.L214P錯義突變體，及c.235delc、p.Y155X、c.572delT和c.631-632delGT截短蛋白

11、突變體在體外真核細胞表達載體HeLa細胞不能運輸至細胞膜上形成間隙連接，突變蛋白主要表達和定位于內質網，提示這8個突變蛋白喪失了從內質網轉運到細胞膜的功能。4個不同大小的截短蛋白(c.235delC、c.465 T→A、c.572delT和c.631-632delGT)均不能運輸至質膜，提示其共同缺失的C端對CX26的運輸可能具有重要意義。p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M和p.R165W突變體在HeLa細胞表達后能