IL-33在β-淀粉樣蛋白刺激視網膜色素上皮細胞中的表達及作用機制研究.pdf

1、目的：
　　1.本課題以IL-33作為主要研究對象，研究其在β-淀粉樣蛋白（Aβ）刺激人視網膜色素上皮細胞中的表達特性。
　　2.初步探明IL-33在人視網膜色素上皮細胞中的作用及機制。
　　方法：
　　1.IL-33在β-淀粉樣蛋白刺激人視網膜色素上皮細胞中的表達特性研究
　　采用MTT法檢測不同濃度Aβ1-40刺激D407細胞后不同時間點的細胞存活率，觀察其對視網膜色素上皮細胞損傷的影響。提取不同濃度A

2、β1-40刺激D407細胞24h后細胞RNA，采用定量PCR檢測IL-33mRNA水平；收集細胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測IL-33蛋白表達；加入NF-κB，ERK1/2，JNK，p38MAPK信號通路抑制劑后，采用定量PCR及ELISA檢測0.3μMAβ1-40刺激D407細胞24h后IL-33mRNA及蛋白水平表達，鑒定β-淀粉樣蛋白刺激視網膜色素上皮細胞后調控產生IL-33的信號通路。
　　2.IL-33在人視網膜色素上皮細胞

3、中的作用及機制研究
　　采用定量PCR檢測不同濃度的IL-33刺激D407細胞16h后其受體ST2LmRNA表達情況，流式細胞術檢測100ng/mlIL-33刺激D407細胞16h后細胞表面受體ST2L表達；不同濃度的IL-33刺激D407細胞16h后，收集細胞及培養(yǎng)上清，定量PCR和ELISA檢測炎癥因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-αmRNA和蛋白表達，探討IL-33因子對D407細胞的作用機制；加入NF-κB，ER

4、K1/2，JNK，p38MAPK信號通路抑制劑后，采用定量PCR及ELISA檢測100ng/mlIL-33刺激D407細胞16h后上述炎癥因子的表達，鑒定調控產生炎癥因子的信號通路。
　　結果：
　　1.IL-33在β-淀粉樣蛋白刺激人視網膜色素上皮細胞中的表達特性研究
　　1.10.3μMAβ1-40刺激組較正常組細胞形態(tài)變圓，胞體腫脹，細胞排列數量減少，細胞間間隙增加，且隨Aβ1-40刺激濃度增加變化明顯，而小于0

5、.3μMAβ1-40刺激組細胞形態(tài)無明顯變化。MTT檢測結果表明：隨著Aβ1-40刺激濃度的增加，細胞存活率逐漸下降，除了0.001μMAβ1-40刺激組外，其余各刺激組與正常對照組相比細胞存活率均顯著降低(P<0.05)。隨著0.3μM和1μMAβ1-40刺激D407細胞時間的延長，細胞存活率也逐漸下降，且與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)。
　　1.2不同濃度Aβ1-40刺激D407細胞后，IL-33mRNA及蛋白表達

6、水平均增加，且在0.3μM刺激濃度時表達顯著增加(P<0.05)。結果提示：Aβ1-40刺激D407細胞后能夠引起IL-33表達上調。
　　1.3加入ERK1/2和p38MAPK信號通路抑制劑，0.3μMAβ1-40刺激D407細胞24h后，IL-33mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，但只有加入ERK1/2信號通路抑制劑后，細胞培養(yǎng)上清IL-33蛋白水平才有明顯下降(P<0.05)。結果提示：Aβ1-40刺激D407細胞后

7、，IL-33的產生主要是通過ERK1/2信號通路調控，而p38MAPK信號通路僅參與了IL-33轉錄水平的調控。
　　2.IL-33在人視網膜色素上皮細胞中的作用及機制研究
　　2.1IL-33因子刺激D407細胞后，ST2LmRNA表達顯著增加(P<0.05)，并隨著IL-33刺激濃度的增加而增加，且在100ng/mlIL-33刺激時表達量最高。采用流式細胞術檢測D407細胞表面受體表達結果顯示：D407細胞表面ST2L表

8、達陽性，且在100ng/mlIL-33因子刺激細胞16h后表達上調。
　　2.2采用定量PCR及ELISA檢測IL-33因子刺激D407細胞后炎癥因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-αmRNA及蛋白水平表達。結果顯示：20，50，100ng/mlIL-33刺激D407細胞16h后，炎癥因子mRNA及蛋白水平表達均顯著增加(P<0.05)，且隨著IL-33因子刺激濃度的增加，炎癥因子表達均逐漸增加，并在100ng/mlIL-

9、33刺激時表達量最高。結果提示：IL-33刺激D407細胞后IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α因子表達上調。
　　2.3加入NF-κB，ERK1/2，JNK，p38MAPK信號通路抑制劑，100ng/mlIL-33刺激D407細胞16h后，定量PCR和ELISA檢測炎癥因子mRNA及蛋白水平表達，結果顯示：加入p38MAPK信號通路抑制劑后，IL-6表達顯著下降；加入ERK1/2信號通路抑制劑后，IL-8表達顯著下降；加入

10、NF-κB信號通路抑制劑后，IL-1β表達顯著下降；而加入JNK信號通路抑制劑后，TNF-α表達顯著下降(P<0.05)。結果表明：IL-33因子刺激D407細胞后炎癥因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α的產生是分別通過p38MAPK，ERK1/2，NF-κB以及JNK信號通路調控。
　　結論：
　　1.隨著Aβ1-40刺激濃度的增加和時間的延長，人視網膜色素上皮細胞存活率逐漸下降。
　　2.β-淀粉樣蛋白1

11、-40刺激人視網膜色素上皮細胞后能夠誘導IL-33因子轉錄及蛋白水平表達上調，且IL-33的產生主要是通過ERK1/2信號通路調控，而p38MAPK信號通路僅參與了IL-33轉錄水平的調控。
　　3.人視網膜色素上皮細胞表面表達ST2L受體且隨著IL-33因子刺激濃度的增加ST2L表達量增加。
　　4.IL-33刺激人視網膜色素上皮細胞后能夠上調炎癥因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α的表達。
　　5.在人視