三羧酸循環(huán)酶CS和SDHB對卵巢癌生物學行為mtDNA的作用研究.pdf

1、線粒體是存在于真核細胞的雙層膜細胞器，主要功能是進行三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化反應。幾乎所有的喜氧生物都是以三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化作為產生ATP的主要方式，為細胞的活動提供能量，因此線粒體被稱為“細胞動力工廠”。線粒體基質中除包含三羧酸循環(huán)酶系、線粒體基因表達酶系，還包括線粒體DNA、RNA和核糖體。線粒體是高等動物細胞核外唯一含有DNA的細胞器，其中包含的人線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是可獨立于核DNA之

2、外進行復制、轉錄和翻譯的雙鏈閉合環(huán)狀分子。線粒體DNA可編碼13個與線粒體氧化磷酸化有關的蛋白。當線粒體中三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化通路異常時，例如三羧酸循環(huán)酶表達異常時，線粒體的能量代謝也會發(fā)生異常，進而影響細胞正常功能的實現。檸檬酸合成酶（Citrate synthase，CS）和琥珀酸脫氫酶(Succinatedehydrogenase，SDH)是參與三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化的兩個酶。其中CS是參與三羧酸循環(huán)的限速酶，催化形成產物檸檬酸

3、用于后續(xù)三羧酸循環(huán)，或者轉運至胞質用于蛋白質乙?；椭舅岽x;SDH是三羧酸循環(huán)中唯一的多亞基線粒體膜結合酶，包括A、B、C、D四個亞基，其中SDHB亞基(Succinate dehydrogenasesubunit B)編碼鐵硫蛋白，參與構成酶活性區(qū)域，此外SDH還參與線粒體氧化磷酸化呼吸鏈電子傳遞。CS和SDHB均由核基因編碼，參與線粒體能量代謝。目前，CS在惡性腫瘤中的表達和具體功能有不同的觀點，研究報道胰腺癌和腎嗜酸細胞瘤中C

4、S表達增加，而在多株宮頸癌細胞株中CS表達降低;SDH亞基突變能夠引起多種腫瘤，SDH可能是一種腫瘤抑制基因。以上研究提示三羧酸循環(huán)酶在腫瘤發(fā)生中有重要作用。正常狀態(tài)下，線粒體消耗的部分氧氣會轉化為超氧化物陰離子、過氧化氫和其他過氧化簇(reactive oxygen species，ROS)。與核DNA相比，由于線粒體DNA中無內含子和保護性組蛋白，使得mtDNA容易受ROS攻擊，從而使DNA突變或者拷貝數發(fā)生變化。MtDNA的這種改

5、變會影響線粒體基因的表達和一系列線粒體的功能。因此mtDNA的異常改變進而會影響線粒體氧化磷酸化反應，甚至導致惡性生長狀態(tài)。相反的，當機體三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化異常時，機體會啟動代償機制和應急方式維持能量需求，線粒體DNA拷貝數的增加可能是一種代償機制來應對線粒體呼吸功能異常。文獻報道非霍奇金淋巴瘤(NHL)細胞中線粒體DNA的增加與腫瘤微小殘留病/持續(xù)疾病狀態(tài)(MRD/PD)相關，NHL化療后存活的殘余細胞中還檢測到ATP相關酶CS的

6、上調和SDH的下調，提示CS和SDH與mtDNA的拷貝數有一定關系。卵巢癌是常見婦科惡性腫瘤，由于臨床發(fā)現多是晚期而使死亡率較高。目前卵巢癌治療的瓶頸仍是轉移和耐藥，尋找卵巢癌轉移和耐藥新機制以及探索治療新靶點仍是重中之重。目前，僅有文獻報道CS在鼠卵巢癌模型中活性增加，CS和SDHB在人卵巢臨床標本的表達以及與mtDNA拷貝數的關系并未進行研究。
　　基于上述基礎，本課題針對CS、SDHB和mtDNA拷貝數在卵巢癌的表達進行研究

7、，體外實驗發(fā)現CS基因沉默抑制卵巢癌細胞(SKOV3，A2780)增殖、侵襲、遷移能力，增加化療敏感性，降低mtDNA拷貝數;SDHB基因沉默促進卵巢癌細胞中上述惡性生物學行為，降低順鉑敏感性，提高mtDNA拷貝數。
　　本課題分為三個部分:(1)CS對卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究。(2) SDHB對卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究。(3) CS和SDHB對卵巢癌細胞線粒體DNA相對拷貝數的作用

8、研究。
　　第一部分檸檬酸合成酶對卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究
　　研究目的:
　　研究檸檬酸合成酶(CS)在卵巢腫瘤組織和卵巢細胞中的表達水平，探索其對卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用和機制。
　　研究方法:
　　1.卵巢正常上皮細胞組織原代培養(yǎng)，實時熒光定量PCR和免疫蛋白印跡法檢測人卵巢腫瘤組織和卵巢細胞中檸檬酸合成酶mRNA和蛋白水平;2.設計合成干擾序列基因沉默CS

9、，檢測CS基因沉默對細胞能量水平的影響(ATP、AMPK/P38MAPK);3.檢測基因沉默CS對卵巢癌細胞株增殖、侵襲和遷移的影響（CCK8實驗、Transwell小室）;Western blot檢測增殖相關信號蛋白p-ERK、凋亡相關蛋白（Bcl-2，cleaved caspase3）及細胞侵襲相關蛋白分子(p-FAK，MMP2，Vimentin)的變化;4.檢測CS基因沉默對卵巢癌細胞耐藥性的影響（轉染組和對照組IC50值的變化、

10、細胞凋亡水平、細胞克隆形成能力）;DNA損傷修復角度探討CS參與卵巢癌化療耐藥的機制:Western blot檢測基因沉默前后卵巢癌細胞DNA損傷和修復能力的變化(ERCC1，γ-H2AX);5.基因芯片技術檢測CS基因沉默前后基因水平變化，real-time PCR驗證與耐藥、凋亡和自噬相關基因(CASP7，IRF7，DDX58，ISG15，ATG12）的水平變化。
　　研究結果:
　　1.卵巢癌組織中檸檬酸合成酶表達水平

11、較卵巢良性腫瘤組織高，卵巢癌細胞株SKOV3和A2780中CS水平較卵巢正常上皮細胞(HOSE)高;2.CS基因沉默前后細胞中ATP變化不明顯（P＞0.05），而AMPK/P38 MAPK顯著受抑制(P＜0.05);3.CS基因沉默降低卵巢癌細胞株SKOV3和A2780細胞增殖速度（P＜0.05），促進細胞凋亡（P＜0.05），同時顯著抑制細胞的侵襲和遷移能力(P＜0.05);4.基因沉默CS明顯降低了卵巢癌細胞對順鉑的24小時半數抑制

12、濃度IC50值(P＜0.05)，細胞凋亡水平增加，化療藥物順鉑處理后卵巢癌細胞的細胞克隆形成能力降低(P＜0.05);同時發(fā)現基因沉默CS后，細胞DNA損傷修復能力降低（ERCC1降低），DNA損傷增加(γ-H2AX增加);5.CS基因沉默明顯增加CASP7，IRF7，DDX58，ISG15基因水平(P＜0.05)，而ATG12水平降低，但不顯著(P＞0.05)。
　　結論:
　　CS在卵巢癌組織和卵巢癌細胞中高表達，基因沉

13、默CS能夠顯著抑制卵巢癌細胞的增殖活性，顯著降低卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力，也可以增加卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。CS通過影響ERK信號通路和細胞凋亡影響卵巢癌細胞的增殖活性，通過影響MMP2，p-FAK和Vimentin蛋白分子影響卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力。CS沉默通過降低癌細胞DNA損傷修復能力、增加DNA損傷提高卵巢癌細胞的化療敏感性。
　　第二部分琥珀酸脫氫酶B亞基對卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究

14、　　研究目的:
　　研究琥珀酸脫氫酶B亞基(SDHB)在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達水平。探索SDHB對卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的影響，并進一步研究其中的相關機制。
　　研究方法:
　　1.Real-time PCR和Westem blot檢測SDHB在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達水平;2.Western blot檢測不同卵巢癌細胞株中SDHB蛋白水平;3.SKOV3和A2780細胞中琥珀酸脫氫酶

15、B亞基基因沉默，檢測基因沉默對細胞能量水平的影響（ATP、AMPK/P38MAPK）;4.檢測基因沉默SDHB對卵巢癌細胞株增殖、侵襲和遷移的影響（CCK8實驗，Transwell小室）;Western blot檢測增殖相關信號蛋白p-ERK、凋亡相關蛋白(Bcl-2，cleaved caspase3)及細胞侵襲相關蛋白分子(p-FAK，MMP2)的變化;5.觀察基因沉默SDHB對卵巢癌細胞耐藥性的影響（轉染組和對照組IC50值的變化、

16、細胞凋亡水平、細胞克隆形成能力）;DNA損傷修復角度探討SDHB參與卵巢癌化療耐藥的機制:通過Western blot檢測基因沉默前后卵巢癌細胞DNA損傷和修復能力的變化（ERCC1，γ-H2AX）;6.構建SDHB過表達質粒載體，轉染SKOV3細胞進行功能回復實驗（增殖、侵襲、遷移和化療敏感性相關實驗）;7.從缺氧角度研究SDHB對卵巢癌影響的機制:檢測SDHB基因沉默和過表達對缺氧誘導因子HIF-1α水平的影響;氯化鈷誘導HIF-1

17、α表達，檢測SDHB與HIF-1α表達水平的關系。
　　研究結果:
　　1.SDHB在卵巢癌組織中表達低于正常卵巢組織(P＜0.05)，而且mRNA水平在卵巢癌轉移灶低于原發(fā)灶(P＜0.05);2.不同卵巢癌細胞株中SDHB表達水平不同;3.SKOV3和A2780細胞中SDHB基因沉默降低細胞中ATP水平，AMPK/P38 MAPK上調;4.SDHB基因沉默增加細胞增殖速度，促進卵巢癌細胞侵襲和遷移能力;5.隨順鉑濃度增加，

18、卵巢癌細胞中SDHB水平逐漸升高;基因沉默SDHB明顯增加卵巢癌細胞對順鉑的IC50值(P＜0.05)、減低細胞凋亡水平，增強細胞的克隆形成能力(P＜0.05);基因沉默SDHB后，細胞DNA損傷修復能力增加，DNA損傷降低;6.過表達SDHB后，SKOV3細胞惡性生物學行為（增殖、侵襲、遷移、化療敏感性）部分逆轉;7.SDHB基因沉默增加HIF-1α表達，過表達SDHB降低HIF-1α表達，隨HIF-1α表達增加SDHB水平降低。.<

19、br>　　結論:
　　SDHB在卵巢癌組織低表達，尤其轉移灶中更低?；虺聊琒DHB能夠增加卵巢癌細胞的增殖活性，促進卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力，也可以降低卵巢癌細胞對順鉑的敏感性，而SDHB過表達可逆轉上述惡性生物學行為。SDHB是通過影響HIF-1α表達而影響卵巢癌細胞的惡性生物學行為，通過影響DNA損傷水平影響化療敏感性。
　　第三部分檸檬酸合成酶和琥珀酸脫氫酶B亞基對卵巢癌細胞線粒體DNA相對拷貝數的作用研究

20、　　研究目的:
　　研究線粒體DNA相對拷貝數（mtND2/HBB）和線粒體轉錄因子A(TFAM)在卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤中的水平，探索CS和SDHB對線粒體DNA相對拷貝數的影響和相關機制。
　　研究方法:
　　1.Real-time PCR檢測卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織中線粒體DNA相對拷貝數和線粒體轉錄因子A水平;2.Real-time PCR檢測卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織中CS和SDHB基因水平;3.SK

21、OV3和A2780細胞株分別基因沉默CS和SDHB，real-time PCR檢測基因沉默前后mtND2/HBB和TFAM的表達水平;4.從線粒體DNA生成角度分別探索CS和SDHB對線粒體DNA相對拷貝數的影響:Western blot檢測ERK/P38 MAPK水平，real-time PCR檢測基因沉默前后線粒體DNA合成相關因子PGC-1α水平。
　　研究結果:
　　1.卵巢癌組織中線粒體DNA相對拷貝數和TFAM顯

22、著高于卵巢良性腫瘤組織（P＜0.05）;2.卵巢癌組織中CS基因水平顯著高于卵巢良性腫瘤組織(P＜0.01)，而SDHB基因水平卵巢癌組織顯著低于卵巢良性腫瘤組織(P＜0.05);3.CS基因沉默降低顯著卵巢癌細胞SKOV3和A2780中mtND2/HBB水平(P＜0.05)，TFAM水平也降低但是不顯著（P＞0.05）;SDHB基因沉默顯著增加卵巢癌細胞中mtND2/HBB水平(P＜0.05)，而TFAM水平增加不顯著（P＞0.05）

23、;4.CS基因沉默后SKOV3和A2780兩株細胞中ERK和P38磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)，同時PGC-1α基因水平降低但不顯著(P＞0.05); SDHB基因沉默后兩株細胞中ERK和P38磷酸化水平顯著上調（P＜0.05），PGC-1α基因水平上調不顯著(P＞0.05)。
　　結論:
　　卵巢癌組織中線粒體DNA相對拷貝數和TFAM水平均高于卵巢良性腫瘤組織，CS和SDHB表達水平影響卵巢癌細胞株線粒體相對拷貝數