白藜蘆醇對SOD1-G93A小鼠腰髓和運動皮層Bcl-2、Bax表達水平的影響.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化（Amyotrophiclateralsclerosis，ALS）是一種進行性加重的，主要累及上、下運動神經(jīng)元（主要包括脊髓、腦干、運動皮層）的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其典型臨床表現(xiàn)為逐漸進展的肌肉無力、萎縮，感覺系統(tǒng)及括約肌功能一般不受影響。隨著疾病的進展，成人常在發(fā)病后3-5年因累及呼吸肌而死亡，目前尚無有效的治療手段。ALS分為兩種類型:散發(fā)型和家族型，散發(fā)型約占所有確診病人的90％-95％，家族型約占5％-10％，

2、其中約20％的家族型ALS已被證實與Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變有關(guān)。目前關(guān)于ALS的病因及發(fā)病機制尚不是特別明確，亦可能是多種機制共同參與，其中包括遺傳、氧化應(yīng)激反應(yīng)、谷氨酸興奮毒性作用、線粒體功能障礙、異常蛋白質(zhì)聚集和降解障礙、Ca2+超載、軸索運輸障礙、細胞凋亡等。在前期，我們實驗室詳細介紹了線粒體功能障礙包括線粒體分裂、融合以及線粒體自噬在ALS發(fā)展過程中變化及作用，但是不管是線粒體分裂、融合、自噬，還是其他各種

3、機制均有可能通過誘發(fā)細胞凋亡途徑導(dǎo)致ALS疾病發(fā)生和發(fā)展。
　　細胞凋亡(apoptosis)是機體為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、生長發(fā)育所必需的生理過程。機體在生長發(fā)育過程中，細胞會新陳代謝，在產(chǎn)生新細胞同時，發(fā)生突變或者老化細胞就可以通過細胞凋亡機制而被清除，從而維持機體正常穩(wěn)態(tài)及功能。細胞凋亡主要包括三種途徑:死亡受體凋亡途徑、線粒體凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑，而線粒體凋亡途徑是目前研究熱點。Bcl-2家族主要作用位點在線粒體膜上，在線

4、粒體凋亡途徑中起重要作用。Bcl-2家族蛋白分為抗凋亡蛋白以及促凋亡蛋白兩類，其中Bcl-2屬于眾多抗凋亡蛋白中的一種，Bax是促凋亡蛋白的一種，當細胞受到異常信號刺激時，Bax構(gòu)象發(fā)生變化，從胞質(zhì)易位至線粒體外膜上，形成膜通道結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細胞色素C的釋放，從而引起細胞凋亡。有研究證實，在阿爾茨海默病(AlzheimerdiseaseAD)、帕金森病(ParkinsondiseasePD)、ALS動物模型中，Bax、Bcl-2表達均發(fā)生了一

5、定的變化。在ALS動物模型中，通過抑制Bax基因表達，影響線粒體凋亡途徑，不僅減少了運動神經(jīng)元的丟失，并且對于改善軸突變性、延長生存期也起到一定作用。白藜蘆醇是二苯基乙烯家族中一類多酚類化合物，在心血管疾病、癌癥、衰老、神經(jīng)退行性疾病等方面具有有益作用。在朊蛋白病動物模型中，白藜蘆醇能夠減少促凋亡蛋白Bax易位至線粒體外膜上，阻止細胞色素C的釋放，保護神經(jīng)元。那么ALS同樣作為一種神經(jīng)變性病，隨著其疾病進展，細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、

6、Bax的表達發(fā)生了怎樣變化？白藜蘆醇對Bcl-2、Bax又產(chǎn)生了怎樣的影響？有待本實驗進一步證實。
　　SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠是目前研究ALS最為理想的動物模型之一。本實驗旨在觀察不同時期SOD1-G93A小鼠腰髓及運動皮層中Bax、Bcl-2動態(tài)變化情況;以及給予白藜蘆醇處理后小鼠腰髓及運動皮層中兩者表達情況的變化;進一步探討細胞凋亡在ALS發(fā)病過程中的作用;最后評估應(yīng)用白藜蘆醇對ALS治療可行性。
　　方法:選取S

7、OD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗組，根據(jù)病程分為癥狀前期（60天）組、癥狀早期(Onset)組、終末期(End)組，選取90d野生型小鼠作為對照組，各組6只;處理組選取70dSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠，分為白藜蘆醇組、溶劑組、空白組，每組根據(jù)給藥時間不同分2個亞組，每組6只，白藜蘆醇組給予白藜蘆醇乙醇溶液(30mg/kg/d)胃內(nèi)灌注、溶劑組給予同等體積的乙醇溶液胃內(nèi)灌注、空白組不予任何處理，分別連續(xù)灌注至癥狀早期（連續(xù)給藥20-30

8、天）、終末期（連續(xù)給藥50-60天）后取材，以10％水合氯醛(350mg/Kg體重)腹腔注射麻醉，處死小鼠，取腰髓及運動皮層迅速投入液氮冷凍，之后保存于-80℃冰箱;4％多聚甲醛經(jīng)心臟灌注，之后剝離小鼠腰髓及運動皮層，用4％多聚甲醛浸泡保存或用2.5％戊二醛固定組織，利用Westernblot技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)觀察SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓與運動皮層中Bcl-2和Bax的動態(tài)表達情況及給予白藜蘆醇后SOD1-G

9、93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓與運動皮層中Bcl-2和Bax的變化情況。并利用spss13.0對數(shù)據(jù)進行分析。
　　結(jié)果:
　　1.不同時期Bcl-2、Bax在SOD1-G93A小鼠腰髓及運動皮層中表達情況
　　(1)Bcl-2、Bax在SOD1-G93A小鼠腰髓及運動皮層運動神經(jīng)元中表達情況:通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，癥狀早期組和終末期組運動神經(jīng)元中Bcl-2表達量降低，而Bax表達量升高;與對照組相比，癥狀前期

10、組運動神經(jīng)元中Bcl-2和bax表達量無明顯改變。激光共聚焦技術(shù)檢測Bcl-2、Bax與神經(jīng)元標記物SMI32共定位情況:與對照組相比，癥狀早期組和終末期組Bcl-2在運動神經(jīng)元中表達量降低，而Bax在運動神經(jīng)元中表達量升高;與對照組相比，癥狀前期組Bcl-2、Bax在運動神經(jīng)元中表達量無明顯變化。
　　(2)SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓及運動皮層中總的Bcl-2、Bax的含量:與對照組相比，終末期組Bcl-2含量明顯減少，差

11、異有統(tǒng)計學(xué)意義，癥狀早期組及癥狀前期組Bcl-2含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與對照組相比，終末期組和癥狀早期組Bax含量均增多，具有統(tǒng)計學(xué)意義，癥狀前期Bax含量無明顯變化，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.給予白藜蘆醇干預(yù)后不同時期SOD1-G93A小鼠腰髓及運動皮層中Bcl-2和Bax表達情況
　　(1)癥狀早期:通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用白藜蘆醇干預(yù)后，在SOD1-G93A小鼠腰髓及運動皮層運動神經(jīng)元中，與空白組相比，

12、白藜蘆醇組及溶劑組Bcl-2表達量升高，而運動皮層中Bax表達量降低;與溶劑組相比，白藜蘆醇組Bcl-2和Bax表達量無明顯變化。激光共聚焦技術(shù)檢測Bcl-2、Bax與神經(jīng)元標記物SMI32共定位情況:在SOD1-G93A小鼠腰髓運動神經(jīng)元中，與空白組相比，白藜蘆醇組及溶劑組Bcl-2表達量升高，而Bax表達降低;與溶劑組相比，白藜蘆醇組Bcl-2和Bax在運動神經(jīng)元中表達量無明顯變化。Westernblot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn):與空白組相比，

13、在SOD1-G93A小鼠腰髓中，白藜蘆醇組與溶劑組Bcl-2含量升高，而Bax含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與溶劑組相比，白藜蘆醇組Bcl-2和Bax含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)終末組:通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用白藜蘆醇干預(yù)后，在SOD1-G93A小鼠腰髓及運動皮層運動神經(jīng)元中，與空白組相比，白藜蘆醇組及溶劑組Bcl-2表達量升高，而運動皮層中Bax表達量降低;與溶劑組相比，白藜蘆醇組Bcl-2和Bax表達量無

14、明顯變化。激光共聚焦技術(shù)檢測Bcl-2、Bax與神經(jīng)元標記物SMI32共定位情況:在SOD1-G93A小鼠腰髓運動神經(jīng)元中，與空白組相比，白藜蘆醇組及溶劑組Bcl-2表達量升高，而Bax表達量降低;與溶劑組相比，白藜蘆醇組Bcl-2和Bax在運動神經(jīng)元中表達量無明顯變化。Westernblot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在SOD1-G93A小鼠腰髓中，白藜蘆醇組、溶劑組、空白組三組Bcl-2和Bax含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論: