K88ac+產腸毒素大腸桿菌相關新毒力因子的研究.pdf

1、豬源產腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli ETEC）是引起初生和斷奶仔豬腹瀉的重要病原體之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失，還降低了其生產效率。其中K88ac+ETEC是主要的致病菌，其引起的斷奶仔豬腹瀉(porcine post-weaning diarrhea，PWD)甚至導致仔豬發(fā)病死亡。其主要毒力因子包括黏附素和腸毒素。而細菌鞭毛作為一種新的毒力因子，在K88ac+ ETEC致病機理中

2、的作用仍不清楚。本論文中，我們以K88ac+ETEC國內參考株C83902(O8∶H19∶K88ac+ LT+ STa+ STb+)為研究對象，圍繞鞭毛與K88菌毛在細菌致病過程中的作用開展研究。此外通過全基因組測序，深入挖掘K88ac+ETEC中的新型毒力因子，并對其中的alpha菌毛進行鑒定。具體的研究內容如下:
　　1.K88ae+產腸毒素大腸桿菌鞭毛和K88菌毛的協同調控
　　盡管細菌鞭毛已經被普遍認為是一種毒力因子

3、，但是其在導致新生和斷奶仔豬腹瀉的K88ac+產腸毒素大腸桿菌致病機制中的作用不明晰。我們利用λ-Red同源重組技術構建了C83902的△fliC，△faeG，△motA單基因缺失株以及△fliC△faeG雙基因缺失株，通過PCR及測序鑒定缺失株的正確。然后將表達FliC和FaeG的重組pBR322回補質粒分別導入缺失株構建回補株C83902△fliC/pfliC和C83902△faeG/pfaeG。運動性試驗、透射電鏡以及玻板凝集試驗

4、用來確定缺失株和回補株的功能。細胞黏附試驗結果顯示，△fliC和△faeG缺失株對于仔豬空腸上皮細胞系IPEC-J2的黏附能力分別下降20％和96％，△fliC△faeG雙缺失株的黏附能力也下降97％，△motA缺失株和回補株對IPEC-J2的黏附能力與野生株相似。qRT-PCR顯示△fliC缺失株中faeG的轉錄水平較野生株顯著下降21.5％，而△faeG缺失株中fliC的表達水平是野生株的2.08倍;△motA缺失株和回補株中fli

5、C和faeG表達水平均恢復野生株水平。綜合以上結果，我們證明了K88+ETEC中鞭毛和K88菌毛協同調控表達。
　　2.K88ac+產腸毒素大腸桿菌鞭毛和K88菌毛對細菌生物被膜及群體感應的影響
　　生物被膜保護下的細菌對各種抗生素具有高度耐性，并可逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用。利用C83902野生株以及已經構建的△fliC、△faeG缺失株，回補株，通過生物被膜測定試驗比較發(fā)現，△fliC缺失株的生物被膜產生能力較野生株下降

6、47.5％，而在△faeG缺失株其生物被膜形成能力上升1.4倍。由于Ⅱ型群體感應是大腸桿菌重要的信號傳導機制，且參與調控生物被膜的形成，我們檢測了AI-2分子活性并通過qRT-PCR驗證AI-2相關基因的表達情況。相比野生株，△fliC缺失株、△faeG缺失株和△fliC△faeG雙缺失株AI-2分子活性分別下降16.2％、19.1％和21％。qRT-PCR結果顯示△fliC缺失株中l(wèi)uxS和pfs的轉錄表達減少，而在△faeG缺失株中

7、其表達顯著增加。本研究表明了鞭毛和K88菌毛在K88ac+ETEC中，對生物被膜的形成和AI-2群體感應系統(tǒng)都是重要的影響因素。
　　3.細胞脂筏在產腸毒素大腸桿菌鞭毛介導的腸上皮細胞促炎性反應中的作用探析
　　脂筏是分布在細胞膜上富含膽固醇和鞘脂類物質有序排列的微區(qū)，參與很多重要的生物學過程。為探析脂筏是否介導ETEC鞭毛與腸上皮細胞膜相互作用，我們使用甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)預先處理兩種腸上皮細胞系（人結腸癌Caco

8、-2細胞和仔豬空腸上皮IPEC-J2細胞），去除其膜膽固醇，破壞脂筏結構，然后分別與重組大腸桿菌H1、H19鞭毛素孵育;回補組細胞添加外源性膽固醇孵育;對照組細胞全程僅使用培養(yǎng)基孵育。最后通過熒光定量和酶聯免疫吸附試驗的方法，確定對照組、處理組和回補組細胞中Toll樣受體5(TLR5)相關促炎性因子的表達情況。結果顯示，去除膽固醇后，通過鞭毛素激活的細胞內TLR5信號通路中白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)在轉錄水

9、平和蛋白表達水平上均較對照組未預先經MβCD處理的細胞下降約33％。而回補組中IL-8和TNF-α的表達水平與對照組無顯著差異。本研究證明了脂筏中膜膽固醇介導宿主細胞對ETEC的TLR5途徑先天免疫識別。
　　4.全基因組測序K88ac+產腸毒素大腸桿菌C83902
　　綜合現有研究可知參與K88ac+ETEC致病過程中的毒力因子包括菌毛黏附素、鞭毛以及腸毒素等，為了挖掘新毒力因子并完善K88ac+ETEC的致病機制，本研究

10、通過下一代測序技術對C83902進行全基因組測序，獲得C83902的染色體基因組。該序列含有5，148個基因，總長度為4，920，255 bp，GC含量50.8％。CRISPRs分析顯示C83902雖然攜帶CRISPR1和CRISPR2，但在該菌進化中已丟失Cas酶相關基因。前噬菌體分析表明其染色體上含有5個完整的，1個不完整以及1個潛在的前噬菌體。大腸桿菌可以分為5個遺傳譜系(phylogroup):A，B1，B2，D和E。系統(tǒng)進化分

11、析顯示C83902屬于遺傳譜系A組，但與B1組的O104∶H4_2011C-3493，O103∶H2_12009以及人源ETEC菌株E24377的親緣關系更接近。對C83902的毒力因子進行分類和比較后發(fā)現了K88+ETEC上未見報道的alpha菌毛，stf菌毛，sfm菌毛以及l(fā)ong polar菌毛等四種菌毛操縱子;此外，耶爾森菌強毒力島和Ⅵ型分泌系統(tǒng)也作為新的ETEC毒力因子，值得深入研究。
　　5.K88ac+產腸毒素大腸桿

12、菌alpha菌毛的克隆、表達和鑒定
　　針對全基因組測序發(fā)現的多個新型毒力因子，我們選擇了alpha菌毛并對其開展了初步的鑒定工作。根據全基因組測序數據分析獲得alpha菌毛操縱子由四個基因組成。通過BLAST軟件與GenBank上不同大腸桿菌全基因組序列比對，發(fā)現該操縱子主要分布于ETEC，APEC，UPEC等致病菌株。設計引物擴增操縱子并克隆到pET42a(+)中，IPTG誘導該菌毛在大腸桿菌C3040上表達，透射電鏡觀察菌毛