Caveolin-1在脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞F-actin重組中的作用及機(jī)制.pdf

1、第一部分：篩選有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1表達(dá)的siRNA及其毒性檢測(cè)
　　目的:篩選有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞小窩蛋白-1（caveolin-1）表達(dá)的小干擾RNA（small interference RNA, siRNA）序列，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性。
　　方法:設(shè)計(jì)合成針對(duì)caveolin-1的siRNA3條（siRNA422,siRNA548,siRNA710）及一條帶綠色熒光標(biāo)記的通用陰性對(duì)照FAM-s

2、iRNA。在siRNAFect(siRNA transfection reagent)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞。用Real-Time PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染后血管內(nèi)皮細(xì)胞中caveolin-1 mRNA的表達(dá)，Western blot方法測(cè)定干擾后caveolin-1蛋白表達(dá)，比較抑制率，篩選出有效抑制caveolin-1表達(dá)的siRNA。采用磺基羅丹明B法(sulforhodamineB， SRB)分析轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性。
　　結(jié)果:①

3、在siRNAFect相同劑量下，siRNA20、30或40nmol?L-1組轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到85%以上(P<0.01)；②siRNAFect1.3μL復(fù)合10或20nmol?L-1siRNA組細(xì)胞存活率均達(dá)到80%以上（P<0.05）；③siRNA548對(duì)EA.hy926細(xì)胞caveolin-1基因mRNA抑制效果最明顯(P<0.01);④與陰性對(duì)照組及siRNA422、siRNA710相比，siRNA548干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞48h后,ca

4、veolin-1蛋白的表達(dá)量最低(P<0.01)。
　　結(jié)論:① siRNA548對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1表達(dá)的抑制效果最大。② siRNA濃度20 nmol·L-1復(fù)合siRNAFect1.3μL轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低，適合轉(zhuǎn)染。
　　第二部分：Caveolin-1通過(guò)NF-κB途徑調(diào)控LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞F-actin的重組
　　目的:探討小窩蛋白-1（caveolin-1）在脂多糖（Lipopolys

5、accharides，LPS）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞纖維狀肌動(dòng)蛋白解聚中的作用及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法:以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（EA.hy926細(xì)胞株）為研究對(duì)象，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定貼壁融合后，根據(jù)不同的處理分為四組，每組6復(fù)孔：1）對(duì)照組（C組）；2）LPS10μg/ml組（L組）；3）LPS10ug/ml+cav-1-siRNA548預(yù)處理組（S組）；4) LPS10μg/ml+cav-1-siRNA548+L-NAME(N-硝基-L

6、-精氨酸甲酯)10μM預(yù)處理組（N組）。根據(jù)LPS的作用時(shí)間，每組進(jìn)一步分為1、3、6和12小時(shí)組。使用Real-Time PCR測(cè)定各組peNOS-s1177和NF-κB的表達(dá)，同時(shí)采用直接免疫熒光染色法觀察各組F-actin的變化。
　　結(jié)果:（1）與對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)L組和S組的peNOS-s1177表達(dá)均明顯增加（P<0.01），其中 S組 peNOS-s1177表達(dá)更為顯著（P<0.01）；與1h組比較，L組peNOS

7、-s1177在6h時(shí)達(dá)到最大值（P<0.01），12h時(shí)表達(dá)開(kāi)始減少（P<0.05）；而在S組，peNOS-s1177在3h達(dá)到最大值（P<0.05），之后6h和12h表達(dá)逐漸減少（P<0.01）；（2）與對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)L、S和N組的NF-κB表達(dá)均明顯增加（P<0.01），其中L和N組的NF-κB在各時(shí)間點(diǎn)增加更為顯著（P<0.01），而L組和N組之間表達(dá)無(wú)差異（P>0.05）。在S組，NF-κB在3、6和12h表達(dá)顯著降低（P

8、<0.01）；(3)直接熒光染色發(fā)現(xiàn)在給予LPS6h后，EA.hy926細(xì)胞株F-actin出現(xiàn)明顯的解聚和重構(gòu)，其程度隨著時(shí)間的增加而加重。而采用cav-1-siRNA548預(yù)處理細(xì)胞株后，F(xiàn)-actin的解聚和重構(gòu)發(fā)生時(shí)間明顯推遲且程度較輕，并且L-NAME可以逆轉(zhuǎn)上述作用。
　　結(jié)論:（1）caveolin-1參與了 LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞 F-actin解聚的調(diào)控；（2）caveolin-1可能通過(guò)eNOS-NF-κB途徑