蛋白質組學技術的改進及對肝細胞肝癌的研究.pdf

1、目的: 蛋白質組學的研究包括前期的樣本提取與純化;中期的蛋白質分離與分析鑒定;后期的數(shù)據(jù)處理與分析。蛋白質鑒定與基因測序相比，最主要的困難是蛋白質的結構及組成遠比基因復雜，而且蛋白質組是動態(tài)變化的，所以蛋白質的質譜鑒定技術高通量的限制因素之一就是蛋白質的分離技術。傳統(tǒng)的蛋白質組學研究策略是基于二維電泳-質譜技術(2-DE-MS)，二維電泳分離能力有限，而液相色譜(LC)彌補了雙向凝膠電泳的缺陷，由此我們需要探索新型適用于復雜生物樣品中蛋

2、白質酶解及分離技術，來提高蛋白質的質譜鑒定水平。腫瘤性疾病從蛋白質組學角度又被認為是一種蛋白質缺陷病，在其發(fā)生發(fā)展的不同階段，即使在沒有任何癥狀的早期或癌前病變期，在血清中蛋白質水平上往往就已經(jīng)發(fā)生了變化。將新型的蛋白質組學技術和整合方式，應用于臨床腫瘤性疾病的診斷，驗證其在復雜體液蛋白質組學研究中具有一定的可行性。
　　方法: 1、用promega和自主修飾Self-owned胰蛋白酶酶解不同濃度的牛血清白蛋白(bull ser

3、um albumin，BSA)測定其總離子流圖(TIC)并利用ProteomeDiscoverer軟件進行數(shù)據(jù)處理，測定BSA的覆蓋率。2、用自主修飾Self-owned胰蛋白酶酶解BSA，將酶切液用本研究制備的二維一體毛細管色譜柱進行分離，應用高效液相色譜與質譜(nanoHPLC-MS)技術平臺，通過TIC、保留時間(retention time，RT)和信號強度，考察其毛細管色譜柱分離性能及重復性。3、選取2012年3月至2013年

4、6月在天津市第三中心醫(yī)院進行體檢的30例健康人、和肝膽外科進行治療的20例HBV相關性肝炎患者、20例HBV相關性肝硬化患者和20例肝細胞肝癌術前患者的血清，其中血清為納入標準的患者入院伊始未經(jīng)過任何治療的早上空腹血清樣本，借助nanoHPLC-MS技術對蛋白質進行前期處理與分析鑒定，將處理所得數(shù)據(jù)在利用OMSSA軟件進行分析，鑒定蛋白質數(shù)量，為后續(xù)篩選潛在蛋白標志物做準備。
　　結果: 1、用promega和自主修飾Self-o

5、wned胰蛋白酶酶解不同濃度的BSA，即在完全相同的實驗條件下，自主修飾Self-owned胰蛋白酶在nanoHPLC-MS技術鑒定高、中、低濃度BSA的覆蓋率為38.22％、28.34％、13.18％;而用promega胰蛋白酶酶解BSA的覆蓋率為34.93％、26.36％、10.21％。2、用自主修飾Self-owned胰蛋白酶和本研究制備的二維一體毛細管色譜柱聯(lián)用，應用于BSA的分析，通過LTQ-Orbitrap XL質譜進行分析

6、，其在極低濃度條件下，鑒定BSA的覆蓋率為24.22％。3、在完全相同的實驗條件下做兩次，觀察本研究所制備的二維一體毛細管色譜柱的重復性，選取BSA酶切的肽段混合物中相應強度較高的質荷比(m/z)740.4為特征肽段，兩次的RT分別是51.90min、51.95min及信號強度分別是6.77×105、7.42×105。4、通過對蛋白質組學技術改進和整合，利用自主修飾Self-owned胰蛋白酶對血清中提取的蛋白質進行酶解，借助nanoH

7、PLC-MS技術平臺，采用強陽離子交換與反相C18二維一體毛細管色譜柱進行分離和LTQ Orbitrap XL質譜的蛋白準確定量，再利用OMSSA軟件的強大數(shù)據(jù)處理功能對蛋白質進行分析，最終鑒定出3578種蛋白。
　　結論: 通過對鑒定BSA理化性能的統(tǒng)計分析，實驗結果表明自主修飾Self-owned胰蛋白酶具有高催化活性，我們所制備的二維一體毛細管色譜柱具有較好的分離性能和重復性。本研究將這種技術改進和整合方式應用于人血清樣本中

8、，經(jīng)過Self-owned胰蛋白酶酶解、二維一體毛細管色譜柱分離、LTQ Orbitrap XL質譜的蛋白準確定量，再通過OMSSA軟件對前期所得數(shù)據(jù)進行分析，最終鑒定出3578種蛋白。此鑒定的蛋白數(shù)足以支持其后期的數(shù)據(jù)處理，篩選具有潛在表達差異的蛋白標志物。為后續(xù)尋找肝臟腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有早期診斷、監(jiān)測價值的蛋白標志物打好基礎。由此可推斷此種方法在蛋白質組學研究中具有一定的可行性，可以在液-質聯(lián)用系統(tǒng)中用于復雜體液、細胞或組織等復