雪旺細胞與異種骨支架的體外復合培養(yǎng)研究.pdf

1、隨著組織工程骨研究的深入,用于較小骨缺損治療的顆粒工程骨技術已基本達到臨床治療要求;但針對大段骨缺損治療的工程骨技術,與臨床應用尚有較大距離。從仿生學角度重建工程骨的神經支配及血液供應,將有望克服目前工程骨骨修復效果欠佳,力學性能較差等缺陷;既往研究發(fā)現(xiàn)神經組織存在于骨組織中且參與骨代謝的調節(jié),動物實驗也表明當骨支配神經遭到破壞后,支配區(qū)域骨組織密度明顯下降,生物力學性能也嚴重受損[1],故此我們認為骨神經化可能是改善組織工程骨修復效果

2、的關鍵問題。雪旺細胞作為外周神經髓鞘細胞,廣泛應用于中樞、周圍神經損傷的重建研究,其通過機械性引導,分泌神經生長因子(NGF)、促突起生長因子(NPF)、軸突誘導因子,促進髓鞘化等方式引導神經軸突再生[2-3],故此本實驗以雪旺神經細胞培養(yǎng)、支架材料鑒定、細胞材料復合培養(yǎng)為主要研究內容,首次探索雪旺細胞在三維骨支架上的生物學特性,為骨神經化的研究開辟道路。我們選擇在神經再生研究中應用廣泛的大鼠雪旺氏細胞(Schwann’s cells:

3、SCs),臨床常用的人同種異體骨作為實驗對象;從大鼠雪旺細胞(SCs)原代培養(yǎng)方法改進,人同種異體骨支架的制備觀察、毒性檢測,及SCs在三維骨支架上的生長特性三個方向設計實驗;目的為改進原代SCs培養(yǎng)技術,參照二維培養(yǎng)模式,觀察三維培養(yǎng)模式下骨支架空隙結構、材料理化特性等對SCs生長狀況的影響。
　　一、雪旺細胞(SCs)原代培養(yǎng)方法的改進及驗證
　　既往文獻報道SCs培養(yǎng)主要障礙是:細胞增殖慢、易凋亡、生長周期短,易被成纖

4、維細胞污染;針對以上問題我們從培養(yǎng)基成分、取材及培養(yǎng)步驟、純化方法等方面進行了技術創(chuàng)新,以提高SCs增殖速度及純度。方法:配置新型培養(yǎng)液,綜合應用谷氨酰胺(Gsn)、牛垂體提取物(BPE)、腺苷酸環(huán)化酶激活物(forskolin)等雪旺促生長因子;取P2代細胞,實驗組用新型培養(yǎng)液,對照組采用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)1-8天,行細胞形態(tài)學觀察、MTT法細胞增殖檢測;取P0代采用多次、雙向差速法,阿糖胞苷分段抑制法等改進純化方法,對SCs進行處理,傳

5、至P1代行S-100+DAPI免疫熒光染色,激光共聚焦檢測,分析圖片計算純度,與既往經典培養(yǎng)方法文獻報道結果對比。結果:相差、共聚焦顯微鏡結果顯示 SCs形態(tài)良好、增殖正常;細胞增殖檢測:第1-3d兩組細胞光吸收值比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),第4-8d實驗組光吸收值高于對照組,經統(tǒng)計學分析差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);P1代SCs純度為95.89±3.45％,高于既往文獻95%的純度報道,且純度隨代數的增加而提高。結論:

6、新型促增殖培養(yǎng)液可促進SCs增值,純化方法提高了SCs純度,新培養(yǎng)方法可為骨神經化的研究提供優(yōu)質的SCs細胞。
　　二、異種骨支架材料的制備與檢測
　　目的:制備異種骨支架材料即人同種異體骨,支架材料形態(tài)學觀察,檢測材料孔徑、孔隙率及細胞毒性;方法:支架材料制備、儲存由西京醫(yī)院綜合骨庫完成;體式解剖顯微鏡支架形態(tài)學檢測;液體替代法檢測材料孔隙率;掃描電鏡圖片檢測分析材料孔徑范圍;提取材料浸提液細胞毒性檢測,實驗組:細胞培養(yǎng)液

7、添加材料浸提液,對照組:不添加浸提液,細胞計數法檢測兩組細胞增值規(guī)律;結果:材料孔隙率(porisity)為78.26±2.95%,孔徑:300-1000μm,支架材料具有良好的三維孔隙結構;兩組細胞生長曲線趨勢一致,絕大多數時間點細胞數量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)結論:材料成分對細胞增殖無明顯毒性反應,人同種異體骨支架的空間結構、理化性能有利于骨神經化的進行。
　　三、二維平面、三維立體雪旺細胞(SCs)培養(yǎng)模型的建立與研

8、究
　　目的:研究三維立體結構對SCs增殖的影響,驗證骨支架材料與SCs的生物相容性,總結神經細胞與骨支架復合培養(yǎng)的規(guī)律。方法:制備鼠尾膠原;實驗分組:三維培養(yǎng)實驗組(SCs+骨支架材料),二維培養(yǎng)對照組(SCs+膠原玻片);細胞增殖檢測:培養(yǎng)1-8d,計數法檢測兩組細胞增殖規(guī)律并繪制生長曲線;SEM檢測:復合培養(yǎng)后3d、7d兩組取樣掃描電鏡檢測。結果:兩組細胞生長曲線整體變化趨勢相近,主要時間點細胞數差異經統(tǒng)計學分析,無統(tǒng)計學意

9、義(P>0.05);SEM檢測:兩組細胞均可正常粘附生長,無明顯細胞固縮或崩解現(xiàn)象,細胞梭形形態(tài)、串珠及肩并肩特征性排布方式,較之前相差顯微鏡、免疫熒光檢測結果未見明顯改變,圖片分析可見第3d,實驗組細胞胞體長度(50-100μm)明顯長于對照組(40-50μm),第7d,兩組細胞長度相似(50-100μm),實驗組細胞表現(xiàn)出明顯孔內遷移趨勢。結論:支架材料與SCs的生物相容性和鼠尾膠原相仿,均良好;二維、三維狀態(tài)下細胞增殖速率無明顯差