豬等孢球蟲生活史研究及其單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立.pdf

1、20頭3日齡仔豬接種2×105個(gè)豬等孢球蟲孢子化卵囊，在接種后6h～144h內(nèi)分期剖殺，取十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、肺、氣管、腸淋巴結(jié)、肝和膽囊等各部位組織塊放入4％的中性福爾馬林中固定，然后做石蠟切片用H．E染色，Olympus顯微鏡觀察并拍照，并測(cè)定各階段蟲體大小，對(duì)豬等孢球蟲的生活史進(jìn)行觀察。在內(nèi)生性發(fā)育過程中，豬等孢球蟲有3個(gè)無(wú)性繁殖和一個(gè)有性繁殖階段。第一代無(wú)性繁殖階段在感染后2～3天最突出，Ⅰ型裂殖體是縱長(zhǎng)的，

2、大小為7．5～12．5μm×4～6μm，平均10μm×4．7μm。Ⅰ型裂殖子和Ⅰ型裂殖體外形相似，大小為7．5～2．5μm×2．5～5．0μm。第二代無(wú)性繁殖階段主要出現(xiàn)在感染后3～4天，產(chǎn)生2～4個(gè)裂殖子，單個(gè)或成群的Ⅱ型裂殖子位于同一寄生空泡，大小為5～10μm/2．5～5μm；感染后4～6天出現(xiàn)第三代無(wú)性繁殖階段，裂殖體是球形或卵圓形的，包含2～12個(gè)核，Ⅲ型裂殖體的大小為7．5～10μm×3．5～7．5μm。Ⅲ裂殖體產(chǎn)生2～12

3、個(gè)新月形的裂殖子。偶見這些裂殖子通過殘?bào)w聯(lián)在一起。Ⅲ型裂殖子的大小為4．75～8μm×1．25～1．5μm。成熟的有性繁殖階段主要出現(xiàn)在感染后5～6天。這些階段的蟲體寄生于小腸的腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)和腸腺上皮細(xì)胞內(nèi)。大腸和其他組織內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)生發(fā)育階段蟲體。DPI120h，在收集的糞便中發(fā)現(xiàn)卵囊，潛隱期為5d，顯露期為7d。28℃下卵囊最早孢子化時(shí)間為26h。在裂殖生殖后期、配子生殖和卵囊排出期間組織病變比較明顯，主要包括腸粘膜上皮壞死和脫

4、落、腸壁水腫、和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及腸絨毛萎縮等，尤以回腸及其鄰近部位最為嚴(yán)重。感染豬腹瀉、食欲下降、消瘦乃至死亡。 將豬等孢球蟲卵囊用飽和鹽水漂浮法收集，然后用蔗糖密度梯度離心、濾器過濾、多次低速離心提純后，通過凍融和超聲波處理的方法制備抗原免疫Balb/c小鼠，以PEG4000為促融劑，取陽(yáng)性的小鼠脾細(xì)胞與NSO骨髓瘤細(xì)胞融合。經(jīng)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，有限稀釋法進(jìn)行3次克隆，獲得1株分泌抗豬等孢球蟲單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞