棉花防衛(wèi)反應相關基因類似物的克隆與特征分析和受黃萎病誘導表達的兩個全長cDNA的獲得.pdf

1、植物在自然界中受到許多病原物的威脅，如病毒、細菌、真菌、線蟲等。棉花是重要的經濟作物，棉纖維是主要的紡織原料。而棉花的病害比較多，我國枯萎病、黃萎病尤其嚴重，給棉花生產造成很大的損失．實踐證明，種植抗病品種是防治病害的最經濟有效的方法。陸地棉是我國棉花的主栽品種，陸地棉抗枯萎病育種非常成功，但黃萎病抗病品種的培育一直是育種家的一大難題，主要原因在陸地棉中找不到免疫或高抗的黃萎病抗源。根據其他作物中克隆的抗病基因與防衛(wèi)反應基因的信息，分離

2、鑒定棉花抗病基因類似物(resistance gene analogs，RGAs)與防衛(wèi)基因類似物(defense gene analogs，DGAs)，有助于直接克隆或開發(fā)與棉花抗病基因緊密連鎖的標記，定位、克隆抗病基因，為培育抗病品種奠定基礎。 本研究選用我國遺傳研究和育種廣泛利用的抗黃萎病品種海島棉海7124(G.brbadense L.cv.Hai7124)為材料來克隆抗病基因類似物(RGAs)和防衛(wèi)基因類似物(DGAs

3、)。成功分離了79條核糖體結合位點(Nucleotide bindingsite，NBS)類RGAs，21條絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶(Serine／Threonine kinase，STK)類RGAs和11條DGAs。棉花中已經報道的NBS類RGAs有143條，我們分離的79條NBS類RGAs中1 3條與已克隆的棉花RGAs沒有序列相關性，其它66條序列與已克隆的棉花RGAs有85％～99％的序列同源性．將本研究分離的79條NBS類RGA

4、s與先前克隆的143條RGAs進行聚類分析，所有這些NBS類RGAs可以分為十個亞類(I-X)，其中亞類IX的所有成員由本研究克隆的5條序列組成。與其它雙子葉作物中得到的結果類似，我們分離的具有連續(xù)開放讀框的NBS類RGAs依其氨基酸序列可以分為兩類，具有Toll-白介素-l受體(To11-Interleukin-1 receptor，TIR)與不具有該結構的non-TIR。這兩類RGAs都存在NBS類RGAs保守的六個基元：P-1oo

5、p、RNBS-A、Kin-2、RNBS-B、RNBS-C、GLPL。鑒定了棉花TIR與non-TIR各自所特有的RNBS-A序列。為棉花R基因和NBS類RGAs的分類提供依據。對STK類RGAs進行BLASTx發(fā)現(xiàn)與雙子葉作物的激酶類蛋白具有高的同源性。將具有連續(xù)ORF的20條sTK類RGAs翻譯成氨基酸，按序列相似性可分為兩類，每類含有10條序列。另外將這20條氨基酸序列與已克隆的番茄的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶與水稻的受體類似蛋白激酶進行

6、多序列比對。鑒定了I-VII七個STK類抗病基因的保守基元。分離的11條DGAs與GenBank中的病程相關蛋白具有較高的同源性。4條DGAs具有連續(xù)的ORF，它們的翻譯產物與柑橘和三葉膠的β-1，3-葡聚糖酶之間表現(xiàn)出很高的同源性。植物功能相關但序列高度歧化的抗性基因或其類似物常成簇排列在植物基因組上。隨機調取4條TIR-NBS與4條non-TIR-NBS類RGAs，Southern雜交顯示3條non-TIR-NBS類RGAs具有相同

7、的帶型，可能這些序列在基因組上成簇分布。在被分析的8條序列中，5條有5個以上的家族成員．這可能是由于在長期的協(xié)同進化過程中，抗性位點必須保持多樣化以適應病原物的多變性。為了鑒定與抗黃萎病相關的RGAs，用具有連續(xù)ORF的48條NBS類與20條sTK類RGAs，4條DGAs設計特異引物，以接茵黃萎病菌后棉花根為材料對這些RGAs進行RT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)有6條NBS類與1條STK類RGAs受黃萎病誘導表達，1條DGAs接菌黃萎病后上調表達

8、。抗病基因類似物多態(tài)性(Resistance gene analogs polymorphism，RGAP)與(Defense gene analogs polymorphism，DGAP)標記常和抗性位點相連鎖。我們用克隆的RGAs與DGAs設計特異引物，以開發(fā)RGAP與DGAP，并將7個標記定位于棉花染色體上。利用受黃萎病上調表達的一條DGA和黃萎病誘導表達的一條STK類RGA，設計RACE引物，成功克隆了這兩個基因的cDNA全長，

9、分別與β-1，3-葡聚糖酶與受體類似蛋白激酶高度同源，命名為CbCLU和GbRLK。對這兩個基因編碼產物的結構進行了分析，它們分別含有糖基水解酶和激酶的保守結構域。Southern雜交顯示，GbGLU在基因組里可能有一個拷貝，而GbRLK有兩到三個拷貝。通過Northern對其表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，與RT-PCR結果相吻合，GbGLU在黃萎病誘導后24h有微量表達，到96h表達量最強；GbRLK只在接菌黃萎病后96h表達，其它時期不表達