ICOS—ICOSL共刺激途徑調(diào)控動脈粥樣硬化的免疫機制及他汀藥物的干預作用.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是目前人類發(fā)病率最高、危害最大的疾病之一。其發(fā)病機理非常復雜，目前尚未明了。曾有多種學說從不同角度來闡明AS的病因，諸如脂肪浸潤學說、血栓形成學說和損傷反應學說等。但多數(shù)學者認為，AS的發(fā)生是多種因素在多重層次上綜合作用的過程，因而不可能有單一的病因。經(jīng)過近百年不懈的努力，人們已經(jīng)認識到肥胖、高脂血癥、高血壓、糖尿病以及吸煙等是引起AS的危險因素。但是，許多發(fā)生冠心病事件的患者其血脂水

2、平并非很高，F(xiàn)raminghamHeartStudy26年的隨訪數(shù)據(jù)顯示，超過1/3的冠心病患者總膽固醇水平＜200mg/dl；大量臨床資料亦顯示，無吸煙飲酒史且血壓血脂血糖均正常的青年男性20歲即出現(xiàn)冠狀動脈漸進性粥樣硬化改變和內(nèi)皮損傷表現(xiàn)。 感染、炎癥和自身免疫三者之間的交叉反應和(或)共同作用引起AS的發(fā)病機制十分復雜，其中T細胞活化是核心環(huán)節(jié)。業(yè)已證實，T細胞激活依賴雙重信號：一個是識別信號，另一個是共刺激信號，識別信號

3、通過抗原提呈細胞(antigen-presentingcell，APC)表面的抗原肽——主要組織相容性復合體(majorhistocompabilitycomplex，MHC)與T細胞表面的T細胞受體(Tcellreceptor，TCR)結(jié)合來完成，具有抗原特異性；共刺激信號通過APC表面的共刺激分子與T細胞表面相應的共刺激分子受體結(jié)合來完成。當APC與T細胞之間同時存在TCR識別信號和共刺激信號時，T細胞活化增殖，進而分泌細胞因子，啟

4、動免疫應答，如果僅有TCR識別信號而缺乏共刺激信號，T細胞將無反應甚至凋亡。 感染、炎癥和自身免疫促進AS形成這一觀點的提出為AS的防治提供了新的思路。免疫調(diào)節(jié)劑及抗生素在防治AS中的作用日益受到關(guān)注，他汀類和阿司匹林的抗炎及調(diào)節(jié)免疫作用正在得到驗證。文獻報道，辛伐他汀(simvastatin，Sim)可減少血管壁上MHCⅡ類抗原介導的T細胞激活和粘附分子的表達，從而減輕AS患者的炎癥反應，長期應用可使心腦血管事件顯著下降。大量

5、臨床試驗顯示阿伐他汀能延緩心臟移植術(shù)后AS的發(fā)生，延長移植物的存活時間，這些均說明他汀類藥物具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用。 本實驗分為三個部分，通過間接免疫熒光、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reversetranscription-polymerasechainraction，RT-PCR)、實時熒光定量PCR(Real-timePCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westernblotting)等方法，檢測ICOS在PBTC及ICOSL在HCAEC

6、表達。接著采用體外細胞共培養(yǎng)實驗，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)，研究ICOS-ICOSL共刺激途徑對AS患者PBTC增殖、細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10分泌以及炎性介質(zhì)sICAM-1和MMP-9表達的影響及其與健康人的差異。最后應用Sim干預ICOS-ICOSL共刺激途徑，探討Sim對ICOS及ICOSL表達、PBTC增殖、細胞因子分泌和HCAE

7、C炎性介質(zhì)釋放的影響。結(jié)果分述如下： 1.ICOS和ICOSL分別表達于人PBTC和HCAEC 1.1間接免疫熒光發(fā)現(xiàn)，ICOS和ICOSL表達的陽性細胞，熒光信號呈點狀，分布于細胞表面，說明ICOS和ICOSL分別表達于PBTC和HCAEC細胞膜； 1.2RT-PCR結(jié)果表明ICOS和ICOSL的mRNA擴增產(chǎn)物片段分別位于相當與Marker368bp和469bp的位置，與預期理論值大小一致；將PCR擴增產(chǎn)物分

8、別進行序列測定，結(jié)果經(jīng)BLAST比對后顯示提交比對的序列與人類基因庫中ICOS及ICOSL的基因序列相吻合； 1.3Westernblotting結(jié)果表明ICOS和ICOSL蛋白片段分別位于相當與Marker55kD和70kD的位置，與理論值大小一致； 1.4Real-timePCR和Westernblotting分別檢測ICOS和ICOSL的mRNA和蛋白表達量發(fā)現(xiàn)，在無任何刺激因素干預時，ICOS和ICOSL分別在培

9、養(yǎng)的PBTC和HCAEC僅有低水平表達，加入ox-LDL(100μg/L)可使ICOS和ICOSL表達信號明顯增加，說明ox-LDL可使ICOS和ICOSL表達上調(diào)。 2.ICOS-ICOSL共刺激途徑在AS形成發(fā)展中的作用 采用細胞共培養(yǎng)，實驗分為4個處理組(n=6)：活化PBTC(T)組、活化PBTC+HCAEC(T+H)組、活化PBTC+HCAEC+ICOS特異阻斷劑hICOS-Ig(T+H+ICOS-Ig)組和活

10、化PBTC+HCAEC+同型對照抗體(T+H+Ig)組。 2.2ICOS-ICOSL共刺激途徑對AS患者細胞因子分泌的作用與健康人不同：實驗分為4個處理組(n=6)：T組、T+H組、T+H+ICOS-Ig組和T+H+Ig組。 2.3ICOS-ICOSL共刺激途徑對AS患者炎性介質(zhì)表達的作用與健康人相同：實驗分為4個處理組(n=6)：活化HCAEC(H)組、活化HCAEC+PBTC(H+T)組、活化HCAEC+PBTC+I

11、COS特異阻斷劑hICOS-Ig(H+T+ICOS-Ig)組和活化HCAEC+PBTC+同型對照抗體(H+T+Ig)組。 3.辛伐他汀對ICOS-ICOSL共刺激途徑的干預作用 3.1Sim劑量依賴性抑制ICOS和ICOSL的表達 10-8、10-7、10-6和10-5MSim組分別作用于PBTC和HCAEC，其ICOS及ICOSL的mRNA和蛋白表達均低于無處理組和ox-LDL刺激組，隨著Sim刺激濃度的增高，

12、ICOS和ICOSL的mRNA和蛋白表達逐漸降低，說明Sim能夠減少ICOS和ICOSL的表達，并呈一定的劑量依賴性。 3.2Sim干預ICOS-ICOSL共刺激途徑對PBTC增殖的作用 實驗分為5個處理組(n=6)：活化PBTC+HCAEC(T+H)組、活化PBTC+HCAEC+ICOS特異阻斷劑hICOS-Ig(T+H+ICOS-Ig)組、活化PBTC+HCAEC+同型對照抗體(T+H+Ig)組、活化PBTC+HCA

13、EC+10-5MSim(T+H+Sim)組和活化PBTC+HCAEC+10-5MSim+10-3MMVA(T+H+Sim+MVA)組。 3.3Sim干預ICOS-ICOSL共刺激途徑對Th1細胞因子分泌的作用實驗分為5個處理組(n=6)：T+H組、T+H+ICOS-Ig組、T+H+Ig組、T+H+Sim組和T+H+Sim+MVA組。 3.4Sim干預ICOS-ICOSL共刺激途徑對Th2細胞因子分泌的作用 實驗分

14、為5個處理組(n=6)：T+H組、T+H+ICOS-Ig組、T+H+Ig組、T+H+Sim組和T+H+Sim+MVA組。 3.5Sim干預ICOS-ICOSL共刺激途徑對sICAM-1和MMP-9分泌的作用： 實驗分為5個處理組(n=6)：活化HCAEC+PBTC(H+T)組、活化HCAEC+PBTC+ICOS特異阻斷劑hICOS-Ig(H+T+ICOS-Ig)組、活化HCAEC+PBTC+同型對照抗體(H+T+Ig)組

15、、活化HCAEC+PBTC+10-5MSim(H+T+Sim)組、活化HCAEC+PBTC+10-5MSim+10-3MMVA(H+T+Sim+MVA)組。 通過上述三個部分的實驗，我們能夠得出以下結(jié)論： ①從定性到定量，不僅在形態(tài)上(熒光顯微鏡下)，而且在mRNA分子水平(RT-PCR/Real-timePCR)和蛋白質(zhì)水平(Westernblotting)證實ICOS和ICOSL分別表達培養(yǎng)的于PBTC及HCAEC細

16、胞膜，ox-LDL可促進ICOS及ICOSL的表達上調(diào)，這為研究ICOS-ICOSL共刺激途徑與AS免疫病理過程的關(guān)系提供了實驗依據(jù)； ②ICOS-ICOSL共刺激途徑可促進健康人PBTC增殖、增加Th1(IFN-γ和TNF-α)和Th2(IL-4和IL-10)細胞因子分泌，并加強HCAEC表達sICAM-1和MMP-9； ③AS患者免疫T細胞活化增殖的ICOS-ICOSL共刺激途徑存在缺陷，ICOS-ICOSL共刺激信

17、號通過影響Th2途徑和炎性介質(zhì)sICAM-1和MMP-9的表達而參與AS的發(fā)生發(fā)展，可能是AS的發(fā)病機制之一； ④Sim可減弱無干預組和ox-LDL刺激組所誘導的ICOS和ICOSL的mRNA和蛋白表達并呈一定的劑量依賴性； ⑤Sim能夠抑制ICOS-ICOSL共刺激途徑誘導的健康人PBTC增殖、Th1(IFN-γ和TNF-α)和Th2(IL-4和IL-10)細胞因子分泌及sICAM-1和MMP-9表達，其機制可能與抑制