急性肝損傷血清誘導骨髓間充質干細胞分化為類肝細胞的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 探討急性肝損傷血清誘導骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchyme stemcells,BMSCs)體外分化為類肝細胞的能力,為利用:BMSCs治療終末期肝臟疾病患者提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 利用全骨髓培養(yǎng)法分離提取大鼠BMSCs,在倒置顯微鏡下觀察所提取的原代細胞的形態(tài)學變化,免疫熒光染色法檢測BMSCs表面特異性標志物CD29及造血干細胞(Hematopoietic

2、stem cells,HSCs)表面特異性標志物CD34的表達。建立急性肝損傷模型:模型組將四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCL4)-大豆油溶液腹腔注射入大鼠后對其進行部分肝葉切除術；假手術組腹腔注射等劑量的生理鹽水后開腹后即關腹,造模后用全自動生化分析儀檢測大鼠血清谷丙轉氨酶(glutamic pyruvic transaminase,ALT)、谷草轉氨酶(Glutamic oxaloacetictransami

3、nase,AST)及總膽紅素值(total bilirubin,TBIL),取大鼠肝臟進行HE染色,倒置顯微鏡下觀察兩組大鼠肝臟病理學改變。將造模組、假手術組大鼠血清及胎牛血清分別用于培養(yǎng)BMSCs,分為實驗組、對照組及空白對照組,實驗組:造模組大鼠血清配制成的培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs,對照組:假手術組大鼠血清配制成的培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs,空白對照組:常規(guī)細胞培養(yǎng)中使用的胎牛血清配制成的培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs。觀察實驗組、對照組及空白對照組培

4、養(yǎng)后BMSCs細胞形態(tài)學變化；用RT-PCR法分別于誘導7d、14d、21d檢測細胞表面肝細胞特異性標志物AFP、ALB、CK-18的表達。
　　 結果:
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)原代的BMSCs,貼壁生長,呈梭形,漩渦狀排列；免疫熒光染色法鑒定BMSCs,熒光顯微鏡下觀察90％細胞表達CD29,不表達CD34。
　　 (2)模型組大鼠血清ALT、AST及TBIL較假手術組均升高,兩組大鼠血清ALT及AS

5、T比較,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001),TBIL比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組大鼠肝臟組織學鏡下病理評分,假手術組大鼠肝臟細胞形態(tài)正常,模型組肝臟細胞胞漿出現(xiàn)空泡,核固縮等壞死征象,模型組病理評分明顯高于假手術組,兩組間比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
　　 (3)倒置顯微鏡下觀察實驗組BMSCs隨時間的延長,逐漸成為三角形,對照組及空白對照組BMSCs形態(tài)仍為梭形,RT-PCR檢測實驗組、對照組

6、及空白對照組細胞表面AFP、ALB、CK-18的表達:
　　 AFPmRNA:肝損傷血清誘導7d細胞表面有AFPmRNA的表達；14d細胞表面AFPmRNA的較誘導表達較7d下調(diào),兩組間比較,差異有顯著統(tǒng)計學(P<0.001),21d時,細胞表面AFPmRNA無表達。對照組及空白對照組細胞在各時間點均無AFPmRNA表達。
　　 ALBmRNA:肝損傷血清誘導7d、14d、21d細胞表面細胞表面均有ALBmRNA的表達,

7、14d與7d比較,ALBmRNA的表達上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),21d與14d比較,ALBmRNA的表達上調(diào),差異有顯著統(tǒng)計學意義(P-<0.001)。對照組及空白對照組細胞在各時間點均無ALBmRNA表達。
　　 CK-18mRNA:肝損傷血清誘導7d、14d、21d細胞表面均有CK-18mRNA的表達。14d與7d比較,CK-18mRNA的表達上調(diào),差異顯著有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；21d與14d比較,C

8、K-18mRNA的表達上調(diào),差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。對照組及空白對照組細胞在各時間點均有CK-18mRNA表達,與實驗組7d相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),與實驗組14d比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與實驗組21d相比,差異顯著有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
　　 結論:
　　 (1)25％(體積比)CCL4-大豆油溶液腹腔注射加10％(切除肝葉重量/肝總重量)肝切除可致急性肝損傷,且