自體骨髓源性成體干細胞移植治療急性腎小管壞死的實驗研究.pdf

1、目的： 建立兔腎臟缺血再灌注(ischemic-reperfusion，I/R)損傷誘發(fā)急性腎小管壞死動物模型，采用經腎動脈灌注途徑向腎臟內移植自體骨髓單個核細胞，觀察骨髓源性干細胞對急性腎小管壞死腎功能的影響和骨髓源性干細胞是否具有向損傷腎組織歸巢的能力及其在腎臟組織中的分布，初步探討骨髓源性干細胞移植促進急性腎小管壞死修復的作用和可能機制，以及細胞移植的有效途徑，為骨髓源性干細胞移植治療急性腎小管壞死提供實驗依據。

2、方法： 1.實驗動物分組：健康日本大耳白兔42只，隨機分成2組，每組21只。①移植組，I/R損傷+自體骨髓單個核細胞腎動脈灌注；②對照組，I/R損傷+等量生理鹽水腎動脈灌注。 2.骨髓單個核細胞的制備及細胞標記：兔髂前上嵴局部注射普魯卡因麻醉后抽取10ml骨髓液，通過密度梯度離心法分離出骨髓單個核細胞，制成細胞懸液，將其移入含10mlDMEM/F12完全培養(yǎng)基的25cm2的培養(yǎng)瓶內，調整細胞濃度為3×105個/ml，加入

3、5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)，使其終濃度為20μmol/L，對骨髓單個核細胞進行標記，置入體積分數為5％的CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。 3.腎臟缺血再灌注損傷模型制備：以3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)兔耳緣靜脈注射麻醉，采用腹部正中切開術分別暴露右腎和左腎，結扎右腎動脈、靜脈和輸尿管后切除右腎；鈍性分離左腎動脈，用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈105min后取出動

4、脈夾，使左腎動脈血流恢復，造成腎缺血再灌注損傷。通過腎功能相關的血生化指標測定及病理組織學觀察確定急性腎衰模型建立成功。 4.骨髓單個核細胞移植：在兔腎臟缺血再灌注損傷模型制備完成并明確左腎動脈血流恢復后于右腹股溝區(qū)切開皮膚，鈍性分離右股動脈，從右股動脈插入導管至腹主動脈進入左腎動脈約0.5cm處，在腹主動脈與左腎動脈分支處下方0.5cm處以一手指按壓腹主動脈以暫時阻斷腹主動脈血流，移植組經導管緩慢勻速注射5ml骨髓細胞懸液，細

5、胞數量為1.5×107個，注射完畢后退出導管，縫合血管壁和皮膚；對照組用同樣方法注射等量生理鹽水。 5.動物一般狀況監(jiān)測：實驗期間觀察兔飲食、活動、皮毛色澤、體重等變化。 6.血生化指標監(jiān)測：I/R損傷前(T0)和I/R損傷后第1、3、5、7、14、21、28天(T1、T3、T5、T7、T14、T21、T28)于兔耳緣靜脈采血1ml，測血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)。

6、 7.腎組織病理組織學觀察及BrdU免疫組化分析：取I/R損傷前和I/R損傷后第1、3、5、7、14、21、28天的左側腎組織，進行病理組織切片，分別行HE、PAS、PASM染色和腎組織BrdU免疫組化檢測。 結果： 1.一般情況：兩組兔I/R損傷后飲水量與I/R損傷前相比均明顯增多，進食減少，第7天后進水、進食均逐漸增多并恢復正常；兩組I/R損傷后均出現困盹、萎靡、活力下降，3天后移植組精神狀態(tài)、活動能力明顯改善；兩組

7、I/R損傷后體毛逐漸干枯，失去光澤，部分出現脫毛，移植組2周后，體毛逐漸開始光滑潤澤；兩組I/R損傷后體重均下降，七天后體重均逐漸增加，至第4周實驗結束時，兩組體重均重于實驗前，但組間差異無統計學意義(P＞0.05)；實驗過程中，對照組于I/R損傷后第1天、第3天各死亡1只，解剖見胸腔內大量胸水，可能與嚴重的腎功能衰竭有關；移植組于I/R損傷后第7天死亡1只，解剖見腸粘連，腹腔大量膿液，可能與術后感染有關。 2.BrdU標記細胞

8、的濃度和時間：非標記組未見BrdU陽性細胞存在；標記24h、48h、72h三組均見BrdU陽性細胞，BrdU陽性反應物位于細胞核，呈棕色、顆粒狀或彌散分布。相同濃度隨著標記時間的延長，標記細胞數目逐漸增多；相同時間隨著濃度的升高標記細胞數目逐漸增多。以20μmol/L為終濃度培養(yǎng)72h，陽性細胞標記率達到最佳，為(97±2.6)％，增加BrdU標記濃度細胞標記率并未見升高。因此，本實驗選用標記72小時、終濃度為20μmol/L作為最佳標

9、記時間和濃度進行后續(xù)實驗，在相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)、生長、增殖與非標記組相比未見異常。 3.血生化指標：I/R損傷前，兩組兔之間SCr、BUN差異無統計學意義(P＞0.05)。I/R損傷后第1天和第3天SCr、BUN均逐漸達到最高水平，但兩組間無顯著性差異(P＞0.05)，以后SCr、BUN逐漸下降，但移植組下降速度明顯快于對照組，第7天后移植組SCr及BUN水平逐漸低于對照組，到實驗觀察結束時的第28天，對照組SCr和BU

10、N分別為(135.6±32.5)μmol/L和(10.9±2.5)mmol/L，移植組SCr和BUN分別為(90.1±11.1)μmol/L和(8.0±1.5)mmol/L，兩組間有顯著性差異(P＜0.05)；電解質無明顯變化。 4.腎組織病理組織學觀察結果：普通病理觀察，I/R損傷后腎小管上皮細胞變性、壞死甚至脫落，部分壞死腎小管可見壞死脫落細胞填塞，病變于腎皮質或皮髓交界處明顯，而腎小球未見明顯異常。隨著時間延長，壞死腎小管

11、逐漸修復，但移植組修復程度明顯好于對照組。 5.腎組織免疫組化檢測結果：腎組織BrdU免疫組化染色結果顯示，對照組BrdU染色陰性，而移植組于細胞移植后第5、7天逐漸顯示腎小管BrdU陽性染色并持續(xù)至實驗結束，并隨著時間的推移，陽性染色逐漸增強。陽性染色主要分布在腎組織外髓質及皮髓交界處，部分腎小球內亦顯陽性染色。 結論： 1.骨髓源性干細胞移植能在一定程度上加速急性腎小管壞死后腎功能的修復。 2.骨髓源