礦質元素含量和氧化還原水平對棉花纖維伸長調控的研究.pdf

1、棉花纖維細胞是自然界中最長的單細胞之一。提高棉花纖維品質能為紡織工業(yè)提供優(yōu)良的原材料?，F在各種生物和非生物逆境因子（高溫、干旱、鹽堿、病蟲害、礦質營養(yǎng)缺乏及重金屬毒害等）對棉花的產量和品質造成的影響日趨嚴重。因此，研究逆境條件下纖維發(fā)育的生物學問題能為纖維品質的改良提供新的方法和思路。本研究以胚珠培養(yǎng)體系為工具，結合轉基因技術研究了礦質元素缺乏及氧化脅迫等逆境因子對纖維品質的影響。并通過一系列的研究闡述了Ca或者K缺乏誘導的信號與激素(

2、ABA、JA)和ROS相互作用調控纖維伸長的分子機制。通過改變GhAPX1基因表達量來調節(jié)纖維細胞內源H2O2和ASA含量的方法，探討細胞內H2O2含量與纖維細胞伸長之間的關系，詳細論述了ASA與ABA調控缺鐵條件下纖維發(fā)育的作用機制。具體結果如下:
　　1.胚珠培養(yǎng)發(fā)現低鈣和低鉀共同作用促進纖維伸長
　　通過胚珠培養(yǎng)系統(tǒng)研究了11種礦質元素含量變化(K、Ca、Mg、P、Fe、Mn、Zn、B、Cu、 Mo和Co)對棉花胚珠和

3、纖維發(fā)育的影響，發(fā)現培養(yǎng)基中礦質元素含量對纖維發(fā)育的作用存在一個最適宜的濃度。缺鈣能夠促進纖維早期的伸長并誘導纖維的褐化（培養(yǎng)2天后），低鉀(2mM或者27 mM)能顯著抑制纖維的伸長。但當培養(yǎng)基中低鉀和缺鈣同時發(fā)生時，纖維長度比對照（低鉀和鈣正常）更長并且纖維褐化顯著向后推遲（8天以后）。通過RNA-seq和離子組含量的分析，發(fā)現缺鈣誘導了XTH/PME等基因的上調表達促進細胞壁松弛，同時激活CIPK6基因的表達促進了K離子吸收，促進

4、了纖維伸長。但是鈣缺乏誘導了胚珠和纖維中大量ROS的累積、JA含量的下降以及ABA的完全缺失，致使胚珠和纖褐化。低鉀(2mM或者27 mM)能夠通過上調抗氧化基因的表達以及提高JA和ABA的含量來抑制褐化。低鈣誘導的細胞伸長與低鉀誘導的信號互補，共同作用促進了纖維的伸長。
　　2.H2O2是纖維伸長的重要調控因子
　　礦質元素的缺乏誘導ROS的累積，誘導組織的褐化并抑制纖維的伸長。H2O2的含量在纖維發(fā)育轉換期(15 DPA

5、)有一個小高峰。在胚珠培養(yǎng)中施加不同濃度的H2O2和ROS生成的抑制劑DPI能夠改變纖維的發(fā)育進程，這些結果說明H2O2能夠調控纖維伸長的過程。為進一步研究纖維中內源H2O2的含量與纖維長度之間的關系，對棉花纖維伸長期(5-10 DPA)優(yōu)勢表達的基因GhAPX1AT/DT的表達量進行了調控。構建了該基因CaMV35S超量表達和特異干涉以及細胞質APX家族干涉的三種載體，并成功轉化陸地棉。通過對轉基因棉花材料纖維品質多年多點的檢測，發(fā)現

6、35S超量表達棉花(OA)和GhAPX1AT/DT特異干涉(IAU)棉花纖維品質變化不大，只有細胞質類型APX干涉(IAO)類型的兩個棉花株系纖維長度(26.06±0.31 mm和25.71±0.63 mm)相比陰性對照(28.42±0.67 mm)顯著降低，下降幅度達8.30％-9.54％。并且纖維整齊度指數，伸長率，成熟度和短纖維指數也都相對于對照下降，纖維品質變差。主要原因是H2O2在細胞質APX干涉系中大量累積，抑制了纖維的伸長

7、，特別是10 DPA纖維中H2O2含量增加了3.5倍。通過RNA-seq技術，在細胞質APX干涉系10 DPA纖維中篩選到126個差異表達基因(DEGs)。其中在IAO株系上調表達的基因大部分在纖維次生壁時期優(yōu)勢表達，并且參與到氧化還原穩(wěn)態(tài)，脅迫響應和次生壁合成等過程。因此，細胞質APX基因是纖維細胞伸長期氧化還原穩(wěn)態(tài)維持的關鍵基因，抑制細胞質APX基因表達會導致H2O2含量的大量累積，誘發(fā)氧化脅迫，刺激次生壁基因在伸長期的提前表達，從

8、而抑制了纖維的伸長。
　　3.降低細胞質APX的表達量能提高棉花缺鐵的耐受性
　　超量表達GhAPX1能夠增加纖維對高溫(37℃)和氧化脅迫(1mM H2O2)的耐受性，細胞質APX干涉株系纖維對高溫和氧化脅迫更加敏感。但是，細胞質APX干涉株系表現出對缺鐵更不敏感的表型。胚珠培養(yǎng)中缺鐵能夠抑制胚珠和纖維的發(fā)育，并在培養(yǎng)10天后誘導組織的褐化。缺鐵誘導的褐化在細胞質APX干涉系胚珠和纖維出現的時間明顯向后推遲，并且胚珠沒有受

9、到缺鐵的抑制，FCR活性相比于正常條件顯著上升，同時細胞質APX干涉系幼苗葉片在缺鐵處理兩周后沒有出現嚴重的黃化，這些結果表明細胞質APX表達的下調提高了棉花缺鐵耐受性。
　　進一步分析表明細胞質APX干涉系缺鐵的耐受性的提高依賴于ASA含量的顯著上升。首先，RNA-seq分析發(fā)現ASA合成和代謝途徑的基因都受到了缺鐵的調節(jié)，ASA含量上升。其次，ASA增加的幅度在缺鐵處理的細胞質APX干涉系中顯著高于對照和超表達系。再次，外源施

10、加ASA能夠抑制缺鐵誘導的褐化，恢復胚珠的鮮重及高鐵還原活性，而外源施加H2O2卻不能達到上述效果。
　　4.ABA能提高棉花對缺鐵的耐受性
　　ASA一方面通過激活鐵吸收相關基因的上調表達增加耐受性，另一方面通過維持ABA的含量來降低缺鐵對胚珠和纖維造成的損害。在缺鐵處理6-10天后，胚珠和纖維中ABA的含量顯著下降，ABA含量下降的速度和比例在細胞質APX干涉系中遠遠低于對照和超表達株系。對ABA合成和降解相關基因的檢測

11、發(fā)現細胞質APX株系缺鐵條件處理10天后，ABA合成相關基因的表達沒有受到抑制;并且ABA降解相關基因的表達受缺鐵誘導上調的幅度顯著低于對照和超表達株系。外源施加10μM濃度的ABA能夠抑制缺鐵誘導的纖維的褐化并能夠恢復缺鐵抑制的高鐵還原活性，說明ABA能胚珠和纖維缺鐵的癥狀。進一步的分析發(fā)現，超表達ABA降解相關基因GhABAH1（脫落酸8'羥化酶）后棉花ABA的含量顯著下降，胚珠和纖維對缺鐵更加敏感，褐化表型早于對照出現。以上結果表