光信號在花生莢果發(fā)育初期的作用機理研究.pdf

1、花生是我國重要的油料作物，油脂和蛋白質二者之和高達80％，是我國食用油和植物蛋白的主要來源。植物果實是多種農作物的收獲器官，果實的正常生長和發(fā)育直接影響種子的產量和品質?；ㄉv果發(fā)育過程與其它植物有很大不同?；ㄉ_花受精后，受精卵僅進行少數幾次分裂形成原胚后便停止進一步發(fā)育，而子房卻不斷伸長形成向地生長的“果針”。當果針將位于其頂端的胚珠推入土壤后，果針停止伸長，而胚胎的發(fā)育在黑暗的條件下重新啟動，并最終膨大形成莢果。大量研究表明，光是

2、調控花生莢果發(fā)育的關鍵因素。由于紅光和遠紅光能可逆地影響花生胚珠的生長，因此，推測感受紅光和遠紅光信號的光敏色素是調控花生莢果發(fā)育的關鍵因子。光信號轉導途徑在模式植物擬南芥中已經有較為深入的研究，光敏色素被光激活進入細胞核后，通過調控下游一系列基因的表達影響不同的生物學過程，如生長素的合成、運輸和響應，赤霉素的合成和信號轉導途徑等。然而，光如何調控花生莢果發(fā)育的分子機制還不清楚。本研究首先分析了花生從受精至果針入土膨大過程中不同發(fā)育時期

3、胚胎的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)果針入土前后、莢果膨大前后是花生莢果早期發(fā)育的關鍵時期，因此選取未入土果針(S1)、入土后未膨大果針(S2)和入土頂端膨大形成“雞頭”形的果針(S3)為材料，進行高通量測序，分析了花生果針尖端胚胎著生部位(ER)和果針基部伸長區(qū)(BR)在這三個時期全基因組水平范圍內基因的表達變化，并以花生栽培品種魯花14號(LH14)為材料克隆了光敏色素基因家族，并對其序列特征、表達模式、蛋白積累水平以及在擬南芥和花生中的遺傳轉化進

4、行了初步研究，同時還克隆了光敏色素互作因子PIF3，驗證了PIF3與花生光敏色素的相互作用，構建PIF3的誘餌載體，進行了酵母文庫互作蛋白質的篩選。主要研究結果如下:
　　(1)花生解剖學和形態(tài)學的觀察結果表明，花生從開花到受精4d后，受精卵經過少數幾次分裂形成“棒狀”的原胚，同時果針不斷向上生長;隨后，“棒狀”原胚暫停發(fā)育，而果針不斷伸長并向地生長;果針入土3d時，原胚開始恢復發(fā)育，胚柄伸長，同時果針頂端由入土前的紫色或綠色變?yōu)?/p>

5、白色;果針入土9d時，果針基部的胚發(fā)育成球形胚，此時，果針頂端膨大呈“雞頭”形。從開花到果針入土前，受精卵經歷了從單細胞到“棒狀”原胚的分裂過程，而在果針向地生長過程中，胚胎的發(fā)育處于相對靜止狀態(tài);果針入土以后，胚胎在黑暗條件下重新啟動發(fā)育，這一過程伴隨莢果的膨大。
　　(2)數字基因表達譜結果表明，光信號轉導途徑以及植物激素如生長素、赤霉素、脫落酸、細胞分裂素和乙烯的合成及信號轉導途徑中的關鍵基因在果針入土前后和莢果膨大前后在E

6、R區(qū)和BR區(qū)的表達發(fā)生改變。例如，ER和BR區(qū)的LSD1蛋白、SPA1蛋白、向光素(phototropin)、早期光誘導的蛋白和rootphototropism蛋白的編碼基因在S2和S3時期的表達水平都低于S1時期的表達水平;ER和BR區(qū)的indole-3-acetic acid-amido synthetase基因在S2時期的表達水平均低于在S1時期的表達水平;ER區(qū)生長素誘導蛋白(auxin-induced protein)基因在S

7、2時期的表達水平低于S1時期的表達水平，而BR區(qū)該基因在S2時期的表達水平高于S1時期的表達水平;ER區(qū)的GA20氧化酶(gibberellin20 oxidase)基因在S3時期的表達水平比S1時期和S2時期高，赤霉素調節(jié)蛋白(gibberellin-regulated protein)基因和GA2氧化酶（gibberellin2-oxidase）基因在S3時期的表達水平比S1時期和S2時期低;BR區(qū)的赤霉素調節(jié)蛋白基因和GA20氧化

8、酶基因在S2時期和S3時期的表達水平低于S1時期，GA2氧化酶基因在S2時期和S3時期的表達水平高于S1時期。果針發(fā)育的不同時期，我們在ER區(qū)鑒定到一些與莢果膨大的相關基因，包括WRKY、MYB、bHLH和MADS轉錄因子家族，以及參與細胞壁合成和降解、調控胚胎發(fā)育的相關基因等。
　　(3)在兩個野生花生Arachis duranensis和Arachis ipa百nsis中各鑒定到4個光敏色素，包括phyA、phyA-like、

9、phyB和phyE。phyA、phyA-like和phyB在兩個野生種中分別位于對應的染色體，且外顯子數目相同，而phyE位于非對應的染色體且外顯子數目不同。野生花生光敏色素基因的長度從2574 bp到3390bp，氨基酸序列的長度從858aa到1130aa。
　　(4)根據轉錄組和野生花生全基因組測序信息，利用RACE和同源克隆等技術在栽培花生LH14中克隆到AhphyA、AhphyA-like、AhphyB和AhphyE的全長

10、CDS序列，分別為3378bp、3378bp、3456 bp和3342 bp，編碼1125aa、1125aa、1151 aa和1113 aa。花生四個光敏色素均包含N端的PAS結構域、GAF結構域、PHY結構域和C端的PRD結構域和HKRD結構域。系統(tǒng)進化分析表明，花生光敏色素與野生花生、大豆、百脈根、苜蓿和豌豆的光敏色素親緣關系較近，與擬南芥、油菜、煙草等光敏色素的親緣關系較遠。
　　(5) qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，四個花生光敏

11、色素基因在花生不同組織及花生果針不同發(fā)育時期的表達有差異。四個花生光敏色素基因在不同組織中均有表達，AhphyA、AhphyA-like和AhphyB在花中的表達量最高，而AhphyE在葉中表達量最高;AhphyA、AhphyA-like、AhphyB和AhphyE在果針三個發(fā)育時期的表達差異不大。
　　(6) Western Blot檢測AhphyA和AhphyB在花生下胚軸及果針中的蛋白積累結果表明，與擬南芥相同，AhphyA

12、在光照處理的下胚軸中降解，降解半衰期約為2h，而AhphyB在下胚軸中的積累對光照處理不敏感;在花生果針的三個不同發(fā)育時期中，均未檢測到AhphyA蛋白的積累，而在入士9d的果針中檢測到AhphyB的積累。結果表明，AhphyB蛋白可能在果針入土以后參與了花生莢果的發(fā)育過程。
　　(7) AhphyA和AhphyB基因在擬南芥中的功能驗證。構建AhphyA基因和AhphyB基因的過量表達載體，通過花序浸泡法轉化擬南芥，經半定量PC

13、R和Western Blot驗證結果表明，AhphyA和AhphyB在擬南芥中正常表達。
　　(8)遠紅光(FR)處理下，異源表達AhphyA基因的擬南芥下胚軸伸長受抑制的程度強于對照，可能是由于AhphyA基因過量表達增強了下胚軸對FR的敏感性，從而抑制了下胚軸的伸長;
　　紅光(R)處理下，異源表達AhphyB基因的擬南芥下胚軸伸長受抑制的程度強于對照，其長度顯著低于野生型擬南芥的下胚軸長度，這說明在紅光條件下，Ahph

14、yB具有抑制下胚軸伸長的功能。
　　(9) AhphyA和AhphyB基因在花生中的轉化。將AhphyA和AhphyB基因構建過量表達載體和干擾載體，通過花萼管注射法，將AhphyA和AhphyB基因的過量和干擾載體轉化花生，經過PCR鑒定，已經初步獲得了轉基因陽性植株。
　　(10)酵母雙雜交實驗結果表明，AhphyA、AhphyA-like和AhphyB的C端均能與AhPIF3互作，而AhphyA、AhphyA-like