PTEN對大鼠原代海馬神經元牽張損傷后AMPA受體GluR2亞單位定位表達的調節(jié)作用.pdf

1、目的：谷氨酸（Glu）的興奮毒性作用是創(chuàng)傷性腦損傷（Traumaticbrain injury，TBI）的重要分子機制。深入研究Glu受體亞單位及其突觸內、外受體組合結構的變化，受體的轉運、表達和再聚合的調控過程，對于深化認識TBI的發(fā)病機制具有重要理論意義。新近研究表明，第10染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因（phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten，PTEN）

2、參與Glu受體的代謝，從而調控Glu的興奮毒性，加重TBI。例如：PTEN可以調節(jié)Glu受體-N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體磷酸化過程，導致NMDA受體興奮性增加，從而致使Glu作用下細胞內Ca2+超載和神經元凋亡。但PTEN對Glu的另一離子通道型受體，α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體的調節(jié)是否存在類似作用尚不清楚，有待深入研究。
　　 AMPA受體是由四種分別由不同基因編碼的亞基，Glu

3、R1，2，3，4組成，其中GluR2亞基由于其mRNAQ/R位點編輯引起的低鈣離子通透性，使得它在AMPA受體中的相對含量決定了AMPA受體的功能特性。GluR2亞基在多種神經元中高表達，這使得鈣離子不能通過AMPA受體內流。因此，GluR2可能是PTEN調控AMPA受體代謝的重要靶點。
　　 方法：本研究選用新生SD大鼠原代培養(yǎng)海馬神經元，建立神經元牽張損傷模型，采用Western-blot和Tunel染色檢測神經元損傷各時相

4、點PTEN表達的變化以及AMPA受體各亞基在細胞中的表達定位變化。利用RNAi慢病毒載體敲減神經元中PTYEN基因的表達，評估PTEN對大鼠原代海馬神經元牽張損傷后AMPA受體GluR2亞單位定位表達的調節(jié)作用以期為PTEN作為預防和治療TBI靶點的臨床策略提供實驗依據。
　　 結果：
　　 1.海馬神經元損傷后PTEN表達水平與AMPA受體亞基表達定位變化的關系
　　 （1）大鼠原代海馬神經元牽張損傷后，隨著時

5、間的推移，凋亡細胞數量比例逐漸增多。
　　 （2）神經元牽張損傷后，PTEN的表達水平增高，2h損傷組PTEN表達水平較未損傷組顯著增高（P<0.05）。損傷24h組PTEN表達水平達到頂峰，損傷48h組PTEN表達水平較損傷24h組低。
　　 （3）牽張損傷0h、2h、6h、24h、48h后，利用Western-bolt檢測大鼠原代海馬神經元總蛋白中AMPA受體GluR1、GluR2、GluR3亞基的表達水平。結果顯示

6、各個組中GluR1、GluR2和GluR3的表達水平無明顯的統(tǒng)計學差異。
　　 （4）Western-bolt檢測結果顯示牽張損傷各時間點大鼠海馬神經元膜蛋白中GluR1和GluR3亞基的表達水平無明顯的統(tǒng)計學差異。但細胞膜中的AMPA受體GluR2亞基在牽張損傷6h、24h、48h后明顯降低。
　　 2.慢病毒介導的PTEN siRNA對大鼠原代海馬神經元牽張損傷后AMPA受體GluR2亞單位定位表達的調節(jié)作用

7、　　 （1）慢病毒介導的PTEN siRNA能夠有效敲減大鼠原代海馬神經元中PTEN的表達。
　　 （2）Neuron組牽拉損傷2h后，可見神經元胞體腫脹。牽拉損傷6h后：可見神經元胞體皺縮，部分細胞連接斷裂，細胞網絡變稀疏。牽拉損傷24h后，可見神經元胞體皺縮明顯，大部分細胞連接斷裂，細胞仍貼壁，但可見許多懸浮死細胞，細胞數量略有減少，細胞網絡消失。牽拉損傷48h后，可見神經元細胞數量明顯減少，可見變性的神經元細胞及細胞碎片

8、。Neuron-PTEN-ND組在牽張損傷0h、2h和6h形態(tài)變化和Neuron組基本一致，牽拉損傷24h和48h后細胞損傷情況明顯較Neuron組輕。Turnel染色證實，兩組細胞在0h、2h和6h凋亡比例無明顯差異，但Neuron-PTEN-ND組在24h和48h凋亡比例明顯低于Neuron組。
　　 （3）Western-bolt檢測結果顯示，牽張損傷各時相點，Neuron-PTEN-ND組和Neuron組總蛋白中AMPA

9、受體GluR2亞單位的含量均無明顯的統(tǒng)計學差異。Neuron組細胞膜中的AMPA受體GluR2亞單位含量在牽張損傷6h、24h、48h明顯降低。Neuron-PTEN-ND組細胞膜中的AMPA受體GluR2亞單位含量在牽張損傷6h無明顯降低，牽張損傷24h、48h后降低。細胞損傷6h、24h、48h，Neuron-PTEN-ND組細胞膜中的AMPA受體GluR2亞單位含量明顯高于Neuron組。
　　 結論：海馬神經元受到機械性