傘枝犁頭霉Absidia corymbifera AS2生物轉化富集黃芪甲苷研究.pdf

1、黃芪甲苷(ASI)是中藥黃芪中一種具有多種藥理活性的皂苷類化合物，為黃芪制劑質量鑒定的指標成分。黃芪甲苷生物活性突出，中藥一類新藥“黃芪甲苷葡萄糖注射液”作為治療缺血性心肌炎的藥物正在進行Ⅲ期臨床研究。但由于黃芪甲苷結構復雜，無法進行化學全合成，因此其來源主要依靠從黃芪植物中提取。而其在黃芪中含量又非常低，需要大量植物資源和有機溶劑，使大規(guī)模制備成為瓶頸。
　　 微生物轉化反應具有專一性強、污染少和轉化率高的優(yōu)點，廣泛用于天然產(chǎn)

2、物的結構改造。本研究在國家重大科技專項(2009ZX09301-011)的資助下，借鑒前人的研究經(jīng)驗，采用微生物轉化富集技術，以黃芪總皂苷作為底物，通過發(fā)酵轉化提高黃芪甲苷含量。主要內容是從篩選菌種開始，建立了發(fā)酵轉化和從發(fā)酵液中分離提取黃芪甲苷的新方法，并成功分離獲得新的關鍵酶-黃芪皂苷去乙?；?。此外，通過對可轉化為黃芪甲苷的前體化合物的鑒定和轉化研究，假設了一條全新的微生物去乙?；患S芪甲苷的途徑。具體研究結果如下：
　　

3、 1、本研究首先從不同來源的霉菌中篩選到能夠高效轉化黃芪總皂苷生成黃芪甲苷的菌種--Absidia corymbifera AS2。以黃芪總皂苷為底物，在投料濃度為5g/L的情況下，轉化60 h，轉化率最高達到90.3％，黃芪甲苷的含量是原料中的3倍。產(chǎn)物黃芪甲苷主要集中在發(fā)酵上清液中，經(jīng)D101大孔吸附樹脂分離純化后，總回收率最高達到了62％，產(chǎn)品色譜純度達到95％以上。該發(fā)酵及純化工藝黃芪甲苷收率高，成本低，操作簡便，避免使用有機

4、溶劑，有利于其工業(yè)化生產(chǎn)。
　　 2、本研究對黃芪總皂苷中可能轉化為黃芪甲苷的前體化合物進行了分析。采用常規(guī)硅膠柱和反相硅膠柱分離的方法，并以A.corymbifera AS2微生物轉化為指導，進行前體化合物的分離和確認，最終共分離到4個可轉化為黃芪甲苷的皂苷類化合物。經(jīng)結構鑒定4個前體化合物分別是astragalosideⅠ(AS-Ⅰ)，isoastragalosideⅠ(isoAS-Ⅰ)，astragalosideⅡ(AS-

5、Ⅱ)和isoastragalosideⅡ(isoAS-Ⅱ)。通過ELSD檢測與DAD掃描相結合的方法對四個前體化合物進行純度鑒定，并采用ELSD吸收圖譜的歸一化法對四個標準品的純度進行標定，結果分別為AS-Ⅰ(97％)、isoAS-Ⅰ(97.4％)、AS-Ⅱ(98％)和isoAS-Ⅱ(98.7％)。建立了黃芪甲苷和4個前體化合物HPLC分析方法和標準曲線，通過對發(fā)酵轉化以及酶轉化過程的實時分析，進行代謝途徑的研究。
　　 3、從

6、化學結構分析來看，AS-Ⅰ(2'3'-di-OAc)和isoAS-Ⅰ(2'4'-di-OAc)比黃芪甲苷多兩個乙?；?；AS-Ⅱ(2'-OAc)和isoAS-Ⅱ(3'-OAc)比黃芪甲苷多一個乙?；＿@些結構均可完全被A.corymbifera AS2轉化為黃芪甲苷，提示該菌株可能存在去乙?；?。為了進一步研究微生物轉化黃芪總皂苷生成黃芪甲苷的機制，本研究繼續(xù)對該微生物中可能存在的去乙?；高M行分離純化。首先采用硫酸銨分步沉淀法濃縮粗酶液

7、中的目標蛋白，再進行Q-sepharose HP離子交換層析，在0.1 mol/L氯化鈉洗脫組份中發(fā)現(xiàn)了較高的酶活性。該組份經(jīng)phenyl-sepharose6 FF疏水層析，收集在0.7 mol/L硫酸銨洗脫的活性組份繼續(xù)進行CHT陶瓷型羥基磷灰石柱層析，在24.5 mmol/L磷酸鉀洗脫組份中發(fā)現(xiàn)有較高的活性。最后采用1 mL Resource Q預裝柱層析獲得電泳純的活性蛋白。酶活力回收率和蛋白回收率分別為0.32％和0.075‰

8、。
　　 4、進一步對分離獲得的黃芪皂苷去乙?；高M行酶學性質研究。以p-NPA為底物在pH7.0和30℃條件下的動力學常數(shù)：米氏常數(shù)Km值為3.76 mmol/L；最大反應速率Vmax為17.64 mmol/min/mg。以p-NPA為底物的最適反應pH為8.0，在pH7.0-9.5范圍內穩(wěn)定；最適反應溫度為35-45℃；在小于45℃溫度范圍內相對穩(wěn)定。MS檢測分子量為36067 Da。采用SPITC修飾的PSD-MALDI質