HPV16感染及宮頸病變與CALCA基因表達調控的關系研究.pdf

1、目的：以往研究報道宮頸癌組織中降鈣素基因相關肽基因（calcitonin-related peptide，CALCA)的啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化，并提示其基因轉錄表達下調或蛋白質表達缺失。人乳頭瘤病毒16（HPV16）持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的重要因素，但是對CALCA基因表達水平的影響機制尚未查證。本課題擬利用維吾爾族婦女宮頸癌標本資源，研究宮頸病變病理進程與CALCA蛋白表達水平變化的關系，同時選擇HPV16陽性宮頸癌細胞和RNAi技術，研

2、究CALCA基因甲基化對HPV16-E7致癌蛋白表達的依存關系。
　　 方法：（1）選擇HPV16-E7基因特異的siRNA片段，構建慢病毒siRNA重組表達載體，經293FT病毒包裝細胞轉染產生重組病毒，并以此感染HPV16陽性SiHa宮頸癌細胞、抗菌素篩選和分子生物學鑒定，建立穩(wěn)定表達HPV16E7-siRNA的RNAi細胞模型。（2）以SiHa細胞和RNAi細胞模型的基因組DNA，選擇CALCA基因啟動子區(qū)富含CpG島嶼的

3、目標片段，經引物設計、PCR擴增、克隆與測序，研究RNAi抑制HPV16-E7表達后，CALCA基因甲基化狀態(tài)的可逆性程度。（3）收集維吾爾族婦女宮頸炎、低度鱗狀上皮內瘤變（LSIL）、高度鱗狀上皮內瘤變（HSIL）和鱗癌（CSCC）患者的石蠟包埋組織標本104例，采用免疫組織化學法鑒定CALCA基因的蛋白表達水平變化。
　　 結果：（1）成功地建立了穩(wěn)定表達HPV16-E7-siRNA片段的RNAi細胞模型，對目標基因（E7）

4、表達的抑制效率，也以蛋白免疫印跡和RT-PCR確證。（2）選出CALCA基因啟動子區(qū)富含CpG位點的目標片段，其大小為365堿基，含有19個CpG島嶼，發(fā)現其中13個CpG位點的胞嘧啶在SiHa細胞基因組DNA中發(fā)生了甲基化（13/19），而在表達HPV16-E7-siRNA的RNAi細胞模型中，所有CpG位點的甲基化已發(fā)生逆轉（0/19位點），同時RNAi干預后，CALCA基因的轉錄上調，蛋白質表達水平增高，證明該該目標片段的甲基化對

5、HPV16-E7致癌蛋白表達存在依賴關系，而且甲基化對該基因表達產生了抑制效應。（3）臨床標本研究顯示，隨著宮頸病變程度加重，CALCA蛋白表達水平呈現從強表達到弱表達缺失或表達缺失的改變，其宮頸炎、LSIL、HSIL和CSCC患者各組的CALCA蛋白“表達缺失率”分別為45.5%（15/33）、75%（12/16）、80.8%（21/26）和82.8%（24/29）,與宮頸病變進程呈負相關（r=-0.361，P<0.01）。