內(nèi)皮生長因子和炎癥因子環(huán)境下單核細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化.pdf

1、淋巴管新生(lymphangiogenesis)與機(jī)體組織許多病理生理過程密切相關(guān),例如:惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移、免疫排斥反應(yīng)、創(chuàng)傷組織修復(fù)、炎癥、繼發(fā)性淋巴水腫等疾病。近些年來乳腺癌發(fā)病率不斷升高,乳腺癌手術(shù)清掃淋巴結(jié)、阻斷淋巴管引起的術(shù)后上肢淋巴水腫病例也隨之增多,對患者的生存質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。因此,研究淋巴管生成機(jī)制對于干預(yù)淋巴管生成、控制惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移、免疫排斥反應(yīng)或組織淋巴水腫等疾病的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等具有重要意義。單核細(xì)胞是外周血

2、單個核細(xì)胞中重要的細(xì)胞群,在炎癥、腫瘤或免疫排斥反應(yīng)時可以在局部浸潤,分化為巨噬細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞,在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能和免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要的作用。近些年來研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞具有多向分化潛能,經(jīng)特定因子定向誘導(dǎo)可以分化成多種細(xì)胞,如上皮細(xì)胞、T細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)或血管內(nèi)皮細(xì)胞等。其中,體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為EPCs或血管內(nèi)皮樣細(xì)胞并用于血管新生的研究成為近些年來關(guān)注的熱點。對于EPCs參與血管新生機(jī)制方面的

3、研究發(fā)現(xiàn),外周血單核細(xì)胞來源的EPCs表現(xiàn)低增殖能力,主要是通過以下方式參與血管新生:直接整合到血管壁；分泌血管內(nèi)皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、趨化因子等促進(jìn)血管新生。與單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、參與血管新生的研究相比,關(guān)于單核細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究尚少。目前的研究發(fā)現(xiàn),單核一巨噬細(xì)胞在炎癥、腫瘤或免疫排斥反應(yīng)等病理過程中浸潤到局部的數(shù)量與淋巴管生成的數(shù)量明顯相關(guān),甚至發(fā)現(xiàn)淋巴管壁有巨噬細(xì)胞的摻入,有文獻(xiàn)報道單核一巨噬細(xì)胞經(jīng)

4、過活化后可以分泌淋巴管內(nèi)皮特異性生長因子VE6F—C等,因此認(rèn)為單核一巨噬細(xì)胞與淋巴管新生有密切聯(lián)系。然而,單核細(xì)胞能否轉(zhuǎn)分化為真正的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞?其轉(zhuǎn)分化條件或機(jī)制為何?尚缺乏足夠的科學(xué)證據(jù),有待于通過體外研究來證實。此外,我們前期的研究發(fā)現(xiàn),單核細(xì)胞在炎性細(xì)胞因子短期刺激下即可表達(dá)部分淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物。因此,本文假設(shè)單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和炎癥因子環(huán)境中可能被誘導(dǎo)分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,或通過分泌VEGF—C等因子來調(diào)控淋巴管新

5、生。
　　 目的:本研究旨在探討人外周血單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞生長因子以及炎癥因子誘導(dǎo)培養(yǎng)下是否能夠分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,及其對VEGF—C等因子的分泌情況,進(jìn)一步探討了單核細(xì)胞參與調(diào)控淋巴管新生的機(jī)制。該研究不僅對于揭示淋巴管新生的新的機(jī)制,而且對于進(jìn)一步將單核細(xì)胞用于干預(yù)淋巴管生成、控制淋巴管相關(guān)疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等具有重要的臨床應(yīng)用意義。
　　 方法:用Ficoll密度梯度離心法從健康人外周血分離獲取單個核細(xì)胞,經(jīng)FN鋪

6、板貼壁法獲取單核細(xì)胞,用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM-2培養(yǎng)細(xì)胞,實驗組加入100 ng／ml的LPS刺激細(xì)胞,分別用免疫細(xì)胞化學(xué),RT—PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR-3、Podoplanin、LYVE—1、Prox-1以及內(nèi)皮細(xì)胞共同標(biāo)志物VEGFR-2、vWF、CD144的蛋白和基因的表達(dá)情況。同時還檢測了新鮮分離的單核細(xì)胞對干細(xì)胞標(biāo)記物CD34、單核細(xì)胞標(biāo)志物CD14的表達(dá)情況,研究其向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化的可

7、能性。收集細(xì)胞培養(yǎng)中的上清,采用ELISA法檢測上清中VEGF—C的含量,進(jìn)一步探討單核細(xì)胞參與調(diào)控淋巴管新生的機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 (1)新鮮分離的細(xì)胞:
　　 ①免疫組化染色顯示細(xì)胞僅對CD14的蛋白表達(dá)為陽性。
　　 ②RT—PCR結(jié)果顯示細(xì)胞僅表達(dá)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR-3和LYVE-1。
　　 ③流式檢測,結(jié)果顯示96.6％±0.7％的細(xì)胞為CD14陽性細(xì)胞；同時表達(dá)CD1

8、4和CD34的陽性率為0.9％±0.2％；同時表達(dá)CD14和VEGFR-3的陽性率為0.1％±0.1％；同時表達(dá)CD14和LYVE—1的陽性率為4.08％±0.3％；同時表達(dá)CD14和Podoplanin的陽性率為0.2％±0.1％。
　　 (2)經(jīng)EGM-2誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的細(xì)胞:
　　 ①熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測顯示細(xì)胞對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)YVE-1、Podoplanin、VEGFR-3以及內(nèi)皮細(xì)胞共同標(biāo)志物VEG

9、FR-2、vWF的蛋白表達(dá)結(jié)果均呈陽性；
　　 ②RT—PCR結(jié)果顯示,EGM-2誘導(dǎo)組細(xì)胞對VEGFR-3、Podoplanin、Prox—1、LYVE-1的m RNA的表達(dá)呈陽性；對vWF、CD144的表達(dá)呈陽性,對于VEGFR-2的mRNA表達(dá)則呈弱陽性或者陰性。EGM-2加LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞對上述標(biāo)記物的表達(dá)均為陽性,對于VEGFR-2的mRNA表達(dá)則呈弱陽性或陰性,與未加LPS刺激組細(xì)胞相比,細(xì)胞對淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物的

10、表達(dá)強(qiáng)度有所升高。
　　 ③流式結(jié)果顯示,EGM-2培養(yǎng)組細(xì)胞對VEGFR-3的表達(dá)率為1.5％±0.2％；LYVE-1的表達(dá)率為11.5±0.3％；Podoplanin的陽性率為1.6％±0.2％。加LPS誘導(dǎo)刺激的細(xì)胞對上述標(biāo)志物的表達(dá)明顯上調(diào):對VEGFR-3的表達(dá)率為26.9％±0.7％；LYVE-1的表達(dá)率為73.6±0.3％；Podoplanin的陽性率為53.1％±0.5％。
　　 ④ELISA檢測EGM-

11、2誘導(dǎo)組細(xì)胞分泌VEGF—C的量為98.2(69.9—153.1)pg／106個細(xì)胞；EGM-2加LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞分泌VEGF—C的量為211.4(179.8—437.8)pg／106個細(xì)胞。二者相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 ①人外周血來源的單核細(xì)胞經(jīng)過FN以及EGM-2等的體外誘導(dǎo)培養(yǎng),細(xì)胞可以同時表達(dá)淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin、Prox-1