葉酸在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的防護作用及其分子機制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是世界五大常見腫瘤之一，其死亡率在惡性腫瘤中居第三位。全球范圍內肝癌的發(fā)生率和致死率居高不下，而在中國尤甚。盡管過去的幾十年里，臨床對肝癌的診斷和治療已經取得了顯著進展，但是還存在一定的局限性。由于肝癌的惡性程度高、預后差、五年生存率仍然很低，因此僅依靠治療并不能從根本上消除肝癌給人類帶來的威脅，在腫瘤預防已成為全球性趨勢的情況下，研究如何預防肝癌的發(fā)生成為當前亟待解決的重要臨床問題。
　　 近年來的研究表明，DNA甲

2、基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化修飾等表觀遺傳學修飾對基因的表達調控起著重要作用，上述表觀遺傳學修飾的紊亂在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用正日益引起人們的重視。而葉酸作為飲食中必需的營養(yǎng)成分，和上述表觀遺傳修飾之間有著復雜的相互作用，能夠通過影響表觀遺傳修飾來調控基因的表達，進而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產生顯著影響。近年來流行病學調查及動物模型研究皆表明，葉酸缺乏可與多種腫瘤相關，例如食管癌、結直腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等。臨床流行病學研

3、究資料表明，體內葉酸水平降低與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，但缺少后續(xù)實驗數據支持且作用機制不清。因此進一步探討補充葉酸對肝癌發(fā)生是否有防護作用及其作用的分子機制，可將其作為一種重要的肝癌化學預防的候選分子，為肝癌的早期預防提供扎實的理論與實驗基礎。
　　 為了探討補充葉酸對肝癌發(fā)生是否有防護作用及其作用的分子機制，我們構建了DEN誘發(fā)肝癌小鼠模型，從其斷奶后即給予不同葉酸濃度的飼料喂養(yǎng)，并于不同時期觀察。結果發(fā)現，補充葉酸可減輕DE

4、N誘發(fā)的肝損傷，并減少肝癌的發(fā)生。而近年來有眾多研究報道稱，EMT和肝損傷、肝硬化及肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，因此我們擬研究葉酸是否通過調控EMT進而調控了肝損傷、肝硬化及肝癌的發(fā)生。我們通過體內、體外實驗，探討葉酸對EMT是否有調控作用。我們首先檢測了DEN模型小鼠肝組織EMT相關標志分子的表達情況，結果發(fā)現，葉酸可以抑制小鼠肝臟EMT。隨后我們在體外實驗中，用不同葉酸濃度的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)人肝細胞12個月，結果證實葉酸可以抑制人肝細胞E

5、MT發(fā)生，提示葉酸可通過抑制EMT抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。與此同時我們發(fā)現，在肝癌的發(fā)生發(fā)展及EMT進程中有染色質修飾的改變。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(LSD1)在染色質修飾改變過程中起著重要作用。有文獻報道稱， LSD1是葉酸的結合蛋白。因此，為研究葉酸是否通過調控LSD1進而調控EMT，我們開展了一系列實驗。體外實驗結果證實，葉酸確實可下調LSD1。之后，我們利用LSD1特異性抗體，組蛋白H3K4Me2特異性抗體，進行染色質免疫共

6、沉淀實驗，證實葉酸通過下調LSD1，降低LSD1在EMT關鍵上皮鈣粘著蛋白基因（E-cadherin，CDH1）啟動子區(qū)域的結合水平，上調該基因啟動子區(qū)域組蛋白H3K4Me2水平，進而上調其表達。最后，我們通過干擾和過表達實驗，證實了葉酸對上皮基因的調控作用依賴于LSD1。綜上所述，本研究證實了葉酸可下調LSD1，減少LSD1于CDH1啟動子區(qū)域的結合，增加CDH1啟動子區(qū)域組蛋白H3K4Me2水平，從而上調了CDH1的表達，抑制EMT