金錢魚促性腺激素基因的克隆、原核表達及功能驗證.pdf

1、在脊椎動物中，性腺的發(fā)育和配子的形成及成熟主要受腦或下丘腦-垂體-性腺軸（BPG&HPG）的調節(jié)。脊椎動物下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素，使垂體分泌促性腺激素（gonadotropin hormones,GtH），即促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）和促黃體生成素（luteinizing hormone,LH）作用于性腺，誘導并調控配子的形成。硬骨魚類中，F(xiàn)SH和LH對生殖調控功能的實現(xiàn)依賴于

2、跟它們的受體相結合，啟動下游信號傳導通路以及激活相關蛋白并誘導性激素的合成并且作用于配子的成熟及排放。
　　本文以實驗室暫養(yǎng)的金錢魚（Scatophagus argus）為研究對象，運用基因克隆技術、原核表達系統(tǒng)、組織學方法、實時定量熒光PCR、酶聯(lián)免疫測定（ELISA），對金錢魚的促性腺激素基因進行克隆與序列分析、原核表達重組載體的構建、重組蛋白的獲得及利用、注射和投喂處理后相關基因的表達、以及血清中性類固醇類激素含量的變化進行

3、了研究及分析。
　　本研究相關結果如下：
　?。?）目的基因的克隆：設計引物并利用基因克隆技術克隆金錢魚LH和FSH的cDNA全長序列的克隆。金錢魚FSH基因全長542bp，ORF為363bp，其編碼120個氨基酸。金錢魚LH的基因全長608bp，ORF框為438bp，其編碼145個氨基酸。將金錢魚FSH和LH氨基酸序列與其它魚類進行同源性比較，系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，金錢魚FSH和LH的進化地位與物種分類的地位是一致的，在進化

4、過程中比較保守。
　?。?）重組蛋白的構建：構建GtH與載體pET-28a的重組質粒，在經(jīng)優(yōu)化后的原核表達條件下，誘導表達獲得可溶的重組FSH和LH融合蛋白。經(jīng)過Ni2+-NTA親和層析柱純化，Western Blot檢測得到純化的FSH和LH重組蛋白，隨后進行金錢魚注射及青鱂（Oryzias latipe）投喂實驗。
　?。?）性腺組織學的觀察：對實驗對象金錢魚和青鱂分別進行注射和投喂試實驗，然后依照組織學觀察方法分別進行

5、了掃描式電子顯微鏡（scanning Electron Microscope, SEM）和蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining, H&E）觀察。經(jīng)注射處理后，掃描隧道電鏡觀察發(fā)現(xiàn)實驗組金錢魚較對照組與空白組而言，卵巢中卵母細胞分化及成熟度較對照組更高。精巢中大部分精母細胞分化為支持細胞和精子，且精子成熟度較高。經(jīng)投喂處理后，組織學切片觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組青鱂較對照組與空白組而言，卵巢中卵子成熟度較高，卵黃顆

6、粒發(fā)育成熟。精巢中，精子細胞基本完全成熟，且部分已經(jīng)排出。
　?。?）相關基因的表達分析：利用相對實時熒光定量PCR技術對金錢魚生殖軸相關基因，促性腺激素受體（gonadotropin hormone receptor,GtHR），抗繆勒氏管激素（anti-Mullerian hormone,Amh），類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein,Star），17β-羥基

7、類固醇脫氫酶（17β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-hsd）等在金錢魚性腺組織中不同表達情況進行研究。經(jīng)重組GtH注射后，SaFSHR和SaLHR表達量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），Amh表達水平顯著下降（P＜0.05），Star和17β-hsd表達升高（P＜0.05，P＜0.05）。
　?。?）類固醇類激素的測定：采用酶聯(lián)免疫測定法對金錢魚血清中性類固醇類激素，即雌二醇（Estrad

8、iol-17β,E2）和11-酮基睪酮（11-keto Testosterone,11-kT）分別進行濃度測定，分別如下：雌性中，E2濃度分別約為312.77 pg/ml（0 dpt），337.90 pg/ml（7 dpt)）和474.57 pg/ml（14 dpt），呈現(xiàn)上升趨勢（P＜0.05）。雄性中，11-kT濃度分別約為70.88 pg/ml（0 dpt），65.67 pg/ml（7 dpt）和135.65 pg/ml（14 d

9、pt），濃度變化明顯升高（P＜0.01）。
　　本研究初步闡述了金錢魚GtH對其HPG生殖軸的調控機制，結果表明FSH和LH激活類固醇合成過程，促進的相關基因GtHR，Star，17β-hsd的表達，進而調控性類固醇激素E2和11-kT的生物合成，并作用于性腺發(fā)育和配子發(fā)生。另外，抑制Amh的表達以促進雌二醇（estradiol,E2）和11-酮基睪酮（11-keto Testerone,11-kT）的生物合成使得卵黃發(fā)生和配子形