霍亂弧菌毒力相關基因和整合子分布特征的研究.pdf

1、[目的]對天津市1964至2008年分離的霍亂弧菌進行毒力相關基因檢測,并對主要的毒力基因進行序列分析,在分子水平上了解霍亂弧菌毒力基因的分布特點和變遷及其流行規(guī)律。了解天津市收集的1995年23株霍亂弧菌耐藥性情況。了解3類整合子在菌株中的分布特征及整合子可變區(qū)攜帶的耐藥基因型,探討整合子在細菌耐藥性產生中的作用。
　　 [方法]采用PCR方法對1964至2008年天津市保存的176株霍亂弧菌的CTXφ基因元件中的ctxAB、

2、zot基因,TLC因子中的cri基因進行檢測。采用PCR方法對隨機選取的不同年代的6株霍亂弧菌進行ctxA、ctxB、cri、tcpA和toxR毒力基因擴增,對PCR產物進行基因測序,利用DNAStar軟件對序列進行拼接及生物信息學分析。采用WHO推薦的瓊脂擴散(改良K-B)法,對天津市保存的1995年的23株霍亂弧菌進行藥敏試驗,按照美國國家臨床實驗室標準化委員會CLSI(2009)文件規(guī)定判斷耐藥、中介和敏感。采用PCR方法對Ⅰ、Ⅱ

3、、Ⅲ類整合酶基因和整合子基因盒的攜帶情況進行檢測。整合子的可變區(qū)擴增陽性的PCR產物經切膠純化后連接到載體pMD18-T simple,轉化入E.coli TOP10中,陽性重組子經PCR鑒定后,進行測序分析。采用BLAST對序列進行比對,確定可變區(qū)所含耐藥基因盒。參照PulseNet監(jiān)測網絡提供的霍亂弧菌PFGE標準操作程序,進行脈沖場凝膠電泳,分析菌株間的同源性。
　　 [結果]176株霍亂弧菌中有131株攜帶CTXφ遺傳單

4、元中的ctxAB、zot基因,陽性率分別為72.72％(128/176株),73.30％(129/176株)。在1964～1996年間分離的01群霍亂弧菌中,有69.00％(69/100株)攜帶cri基因,而1998～2008年間分離的霍亂弧菌中cri基因的攜帶率僅為1.33％(1/75株)。1株0139群霍亂弧菌ctxAB、zot、cri均陽性。6株霍亂弧菌與EVC國際標準株N1696l的多序列比對結果表明:ctxA和tcpA基因問同

5、源均為100％,ctxB、cri和toxR基因間同源性分別99.5％-100％,98.4％-100％和99.4-100％。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合酶基因在霍亂弧菌中攜帶率差異較大:所檢測的23株霍亂弧菌中有19株Ⅰ類整合酶基因陽性,其陽性率為82.61％(19/23株),而Ⅱ、Ⅲ類整合子未檢出。所有Ⅰ類整合子均攜帶一個基因盒aadA1,編碼腺苷轉移酶,介導對鏈霉素(streptomycin)/壯觀霉素(spectinomycin)的耐藥性。攜帶

6、aadA1基因盒的霍亂弧菌對鏈霉素耐藥。脈沖場凝膠電泳結果分析1995年部分霍亂弧菌可能來自同一克隆。
　　 [結論]霍亂弧菌毒力相關基因檢測能反映不同年代菌株間的分子特征,部分毒力基因的測序分析能反映毒力基因的特征,這對于霍亂的分子流行病學研究具有重要意義。臨床上可以選用氨芐青霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素作為治療霍亂的參考藥物。Ⅰ類整合子在1995年分離保存的01群菌株中有較高的攜帶率(82.61％)；藥敏結果表