肝臟祖細胞-卵圓細胞在肝硬化及肝癌中的增殖、與肝臟微環(huán)境關系及部分生物學特性研究.pdf

1、第一部分：一、目的：證實肝硬化組織中存在人肝臟祖細胞(HPCs)，探討HPCs分布及激活的強度與肝臟炎癥程度的關系,提供HPCs向肝細胞分化的依據(jù)。
　　 方法：對30例肝硬化及3例正常組織標本進行常規(guī)組織學觀察，對門脈炎癥程度進行評分，并用膽管上皮標志CK7和肝星狀細胞激活標志SMA進行免疫組化染色，對符合HPCs、中間型肝細胞以及小管樣反應的細胞進行計數(shù)和半定量評分。
　　 結果：在正常肝組織中無門脈周圍HPCs和小

2、管樣反應增殖。在肝硬化組織中，增殖的HPCs起源于肝門脈區(qū)域，隨著門脈炎癥程度加重，HPCs及小管樣反應從肝硬化結節(jié)周圍向肝實質擴散并出現(xiàn)中間型肝細胞增殖，其周圍有顯著的肝星狀細胞激活。HPCs及小管樣反應增殖程度隨著門脈炎癥程度的加重而增加。HPCs數(shù)目與中間型肝細胞數(shù)目之間存在正直線相關。ALT和AST與HPCs及中間型肝細胞數(shù)目存在正直線相關。
　　 結論：在人肝硬化中存在祖細胞的激活，炎癥反應是HPCs激活的觸發(fā)因素，H

3、PCs向肝實質內遷移并向肝細胞方向分化是肝再生的重要途徑。
　　 第一部分：二、目的：研究不同肝臟祖細胞標志物在人肝硬化組織中的定位和分布，明確肝臟祖細胞群的免疫表型特征。
　　 方法：用OV-6，CK7，CK19，Hepatocyte，c-kit以及AFP對30例肝硬化及3例正常肝組織進行免疫組化染色和激光共聚焦免疫熒光雙標，觀察這些標志物在不同細胞群中的分布。
　　 結果：正常肝臟中，膽管和膽小管上皮CK7及

4、CK19陽性，OV-6及c-kit陰性。在肝硬化中，門脈周圍區(qū)域的肝臟祖細胞(HPCs)及小管樣反應細胞主要為OV-6(+)/ CK19(+)/CK7(+)/ Hepatocyte(+)，少數(shù)為OV-6(-)。隨著門脈及實質內炎癥的加重，HPCs及小管樣反應從肝硬化結節(jié)周圍向肝實質擴散并出現(xiàn)中間型肝細胞增殖。HPCs及小管樣反應細胞主要為OV-6(-)/CK19(+)/CK7(+),Hepatocyte(-)或(+)；中間型肝細胞為OV

5、-6(-)/CK19(-)/CK7(+)/ Hepatocyte(+),少數(shù)Hepatocyte(-)。門脈周圍區(qū)域和纖維間隔內存在少量的c-kit(+)細胞，個別陽性細胞整合到成熟膽管，其余c-kit(+)細胞不共表達OV-6、CK7及CK19。
　　 結論：人肝硬化存在肝臟祖細胞的激活；肝臟祖細胞群的免疫表型差異表明祖細胞處于不同的分化增殖階段；不同肝臟祖細胞標志物的聯(lián)合運用是鑒別和研究肝臟祖細胞的有力工具。
　　

6、第一部分：三、目的：研究肝臟祖細胞標志物c-kit、CK7在肝細胞肝癌(HCC)組織中的表達及其與臨床病理的關系。
　　 方法：對40例肝細胞肝癌標本及3例正常組織標本進行常規(guī)組織學觀察以及c-kit、CK7、CD45免疫組化染色，對腫瘤細胞的分化程度進行分型，分析c-kit、CK7表達與肝細胞肝癌的臨床病理特征的聯(lián)系。
　　 結果：正常肝臟中c-kit染色陰性。19/40例HCC組織中存在c-kit(+)腫瘤細胞，在腫

7、瘤細胞之間或腫瘤結節(jié)周圍分散分布。30例(75[％])存在CK7陽性癌細胞，陽性程度強弱不一，主要存在兩種不同免疫反應形態(tài)特征。HBsAg及Anti-HBc在c-kit(+)及CK7(+)HCC表達更常見(p<0.05)，c-kit、CK7表達與腫瘤的分化程度緊密相關(p<0.05)。
　　 結論：骨髓來源的肝臟祖細胞參與了HCC的形成和發(fā)展，c-kit、CK7對于判斷HCC預后有一定意義。
　　 第二部分：目的：闡明在

8、卵圓細胞介導的肝再生中肝臟非實質細胞、胞外基質成分與卵圓細胞的相互作用，分析肝臟微環(huán)境對卵圓細胞的調控作用。
　　 方法：采用免疫組化及免疫熒光雙標的方法動態(tài)觀察在2-AAF/PH大鼠卵圓細胞增殖模型中，隨著卵圓細胞的增殖和分化，Kupffer細胞、肝星狀細胞、肝臟胞外基質成分(層粘連蛋白和纖維連接蛋白)的定位及與卵圓細胞的相互關系。
　　 結果：PH后第2天，小卵圓細胞開始向門靜脈周圍區(qū)域增殖。Desmin(+)的HS

9、Cs及l(fā)aminin主要出現(xiàn)在門靜脈周圍的肝竇狀隙內，而Kupffer細胞和fibronectin在整個肝小葉內表達顯著增加。從術后第4到第9天，卵圓細胞進一步向肝實質內增殖，與HSCs、laminin及fibronectin關系密切，Kupffer細胞與卵圓細胞混合在一起增殖，第6天以后開始減少。從術后第12到第15天，隨著卵圓細胞分化為小肝細胞節(jié)結，大多數(shù)HSCs、laminin及fibronectin位于節(jié)結周邊，少數(shù)出現(xiàn)在節(jié)結內

10、，Kupffer細胞主要出現(xiàn)在中央靜脈周圍區(qū)域。第18天以后，正常的肝小葉結構開始恢復。
　　 結論：在肝損傷后的重建修復過程中，卵圓細胞與肝臟非實質細胞、胞外基質成分存在緊密的聯(lián)系，局部肝臟微環(huán)境可能通過細胞與細胞之間以及細胞與基質之間的相互作用在卵圓細胞介導的肝再生中發(fā)揮重要的調控作用。
　　 第三部分：目的：建立大鼠卵圓細胞增殖模型，探討其分離、鑒定、培養(yǎng)的方法；檢測卵圓細胞端粒酶活性及相關基因表達，探討與其增殖分

11、化之間的關系。
　　 方法：采用2-AAF/PH模型誘導大鼠卵圓細胞增殖，2-AAF劑量為15mg/kg，于術后9-12天采用改良的膠原酶灌注消化密度梯度離心法分離卵圓細胞，用電鏡、RT-PCR、細胞免疫熒光鑒定卵圓細胞，采用免疫組化、RT-PCR及端粒酶活性檢測試劑盒檢測分離的卵圓細胞及卵圓細胞系LE6端粒酶的表達，并分析其意義。
　　 結果：采用2-AAF/PH模型成功誘導大鼠卵圓細胞增殖。分離的卵圓細胞核大，卵圓形

12、，胞漿少，呈鋪路石樣生長，細胞直徑約7～12μm，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)有少量絨毛樣突起，核漿比例大，胞漿內細胞器少且發(fā)育不成熟。細胞免疫熒光、RT-PCR結果顯示表達0V-6、AFP、CK19、Albumin、C-KIT、CK18、Thy-1。免疫組織化學顯示端粒酶催化亞單位TERT表達在門靜脈周圍增殖的卵圓細胞細胞核內，隨著卵圓細胞逐漸向肝細胞方向分化，TERT陽性細胞數(shù)目顯著較少。分離的卵圓細胞及卵圓細胞系均表達端粒酶亞單位TERT及TR，