通絡(luò)方劑對糖尿病大鼠腎臟ERK1-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響及對腎臟保護機制的研究.pdf

1、目的：糖尿病(diabetes mellitus，DM)可以引起視網(wǎng)膜、腎臟、神經(jīng)等多種器官并發(fā)癥，其中糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最為嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病率逐年上升。DN早期主要的病理特點是腎小球基底膜增厚、腎小球系膜細(xì)胞增殖、腎小球系膜的膨脹所致的腎肥大，臨床表現(xiàn)為高濾過和微量蛋白尿。隨著病程進(jìn)展腎小球系膜基質(zhì)增加，促進(jìn)腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，腎臟功能逐漸下降，最終導(dǎo)致終末期腎功

2、能衰竭。目前，體內(nèi)外實驗表明細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白(extracellular signal regulated kinase，ERK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。ERK可被多種生長因子和細(xì)胞因子激活，介導(dǎo)細(xì)胞生長、增殖、分化。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可以刺激血管平滑肌細(xì)胞和腎臟系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞肥大。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是

3、具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷徙，增加血管通透性的細(xì)胞因子。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是促進(jìn)纖維化的細(xì)胞因子。糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)與糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycationendproducts receptor，RAGE)結(jié)合后可促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放，引起血管內(nèi)皮損傷、細(xì)胞外基質(zhì)增生等病理

4、改變。AngⅡ、VEGF、CTGF、AGEs與ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系密切。體外實驗己證實，AngⅡ、VEGF、AGEs可以激活腎臟細(xì)胞ERK通路，促進(jìn)CTGF的表達(dá)。通絡(luò)方劑主要成分是人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、赤芍等藥物。已有實驗發(fā)現(xiàn)通絡(luò)方劑具有改善腎小球基底膜和高糖引起的氧化損傷，增加機體抗氧化能力的作用，能夠減少腎組織中AngⅡ、AGEs產(chǎn)生，但通絡(luò)方劑能否影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前尚不明確。本實驗擬研究通絡(luò)方劑對STZ誘導(dǎo)的

5、糖尿病大鼠腎臟AngⅡ、VEGF、CTGF、RAGE、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表達(dá)的影響，以及通絡(luò)方劑對腎臟保護作用的可能機制。
　　 方法：SPF級成年雄性SD大鼠，體重200g±20g，隨機分組：建模組給予單次腹腔注射STZ60mg/kg，72小時后尾靜脈取血測隨機血糖，以血糖≥16.7mmol/L確定為糖尿病模型，正常組(A組)10只。糖尿病成模大鼠按隨機分為5組：糖尿病非治療組(B組)10只、

6、低劑量通絡(luò)方劑組(C組，0.5g/(kg·d))10只、中劑量通絡(luò)方劑組(D組，1.0g/(kg·d))10只、高劑量通絡(luò)方劑組(E組，2.0g/(kg·d))10只、氯沙坦組(F組，30mg/(kg·d))10只。糖尿病大鼠造模成功后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按分組分別給予不同處理因素，A組和B組給予等體積生理鹽水灌胃，每日定時灌胃，持續(xù)給藥12周后處死，稱量體重，取血檢測血糖(GLU)、血脂(TG、CHOL、HDLC、LDLC)、血肌酐(B

7、CREA)、尿素氮(BUN)，留24小時尿檢測尿肌酐(CREA)、尿蛋白(UPRO24)、尿微量白蛋白(UMA)，取左腎稱重(KW)，計算腎重/體重比(KW/BW)，在透射電鏡以及HE、PAS染色后在光鏡下觀察腎臟病理改變，Elisa法檢測血清及腎臟組織中AngⅡ的含量，免疫組織化學(xué)法檢測p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，Western blot法檢測VEGF、RAGE、CTGF、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，SYBRGreen

8、real-time PCR方法檢測腎組織中的CTGF mRNA、RAGE mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1、造模后的各組大鼠的體重與正常組大鼠比較均明顯減輕(P＜0.05)，C、D、E、F治療組體重較非治療組增加，其中D組大鼠體重較B組明顯提高(P＜0.05)。糖尿病造模各組腎臟肥大指數(shù)較距常對照組明顯增高(P＜0.05)，各糖尿病治療組腎臟肥大指數(shù)較糖尿病非治療組下降，其中D、E、F組較非治療組明顯下降(P＜0.05)。2、糖

9、尿病成模各組大鼠的GLU、TG均較正常組明顯升高(P＜0.05)。各糖尿病大鼠成模組HDLC、LDLC均較正常組明顯降低(P＜0.05)。各糖尿病治療組大鼠與糖尿病非治療組間GLU、TG、HDLC、LDLC均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。各組大鼠CHOL無統(tǒng)計學(xué)意義。3、糖尿病成模大鼠BUN、Ccr、UPRO24、UMA均較正常組明顯升高(P＜0.05)，糖尿病各治療組BUN、Ccr、UMA均較非治療組明顯降低(P＜0.05)，D、E、

10、F治療組24小時尿蛋白較非治療組明顯下降(P＜0.05)，C組UPRO24較非治療組減少但無統(tǒng)計學(xué)差異。4、普通光鏡下觀察A組未見病理改變，B組腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生，腎小管濁腫變性，腎間質(zhì)輕度纖維化。糖尿病各治療組較B組有不同程度改善。透射電鏡觀察可見B組基底膜增厚，足突融合，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞斷裂，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、壞死，C、D、E、F組較B組病變輕。5、B、C、E、F組血清AngⅡ含量較A組明顯升高(P＜0.05)，D組

11、較A組升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。各治療組均較非處理組血清AngⅡ含量明顯降低(P＜0.05)。C、E組血清AngⅡ含量較F組升高有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，D組血清AngⅡ含量與A、F組無統(tǒng)計學(xué)差異。各糖尿病成模組大鼠腎臟組織中AngⅡ含量較正常組明顯升高(P＜0.05)，糖尿病各處理組腎臟AngⅡ含量均較糖尿病未處理組明顯下降(P＜0.05)，D、E組腎臟AngⅡ含量與F組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。6、B、C、D、E、F組中VEG

12、F、RAGE、CTGF、p-ERK1/2蛋白均較A組明顯增加(P＜0.05)，C、D、E、F組VEGF、RAGE、CTGF、p-ERK1/2蛋白表達(dá)較B組減少(P＜0.05)，各組Total-ERK1/2蛋白表達(dá)組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。7、D、E、F組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA的水平較B組明顯下降(P＜0.05)。D、E組大鼠腎臟組織中CTGF mRNA的水平較B組、F組明顯降低(P＜0.05)。與B組相比，C組大