淫羊藿苷對卵蛋白和內(nèi)毒素誘導炎癥反應的影響及機制研究.pdf

1、第一部分，淫羊藿替對卵蛋自誘導大鼠哮喘性氣道炎癥的影響
　　目的:觀察淫羊藿苷對卵蛋白誘導大鼠哮喘性氣道炎癥的影響。
　　方法:(1)72只雄性SD大鼠隨機分為6組,每組12只,分別是正常對照組(PBS)、模型組(OVA)、陽性對照組(OVA+地塞米松組)和OVA+淫羊藿苷低、中、高計量組(5、1O、20mg／kg-1);(2)采用卵蛋白(OVA)致敏和反復激發(fā)大鼠建立哮喘模型;(3)采用HE染色觀察淫羊藿苷對OVA誘導的大

2、鼠肺組織炎癥浸潤的干預作用及病理學評分的影響;(4)觀察6組外周血總細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞計數(shù)情況;(5)采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清中IL-4、IFN-γ、IL-13和TNF-α的含量;(6)取各組大鼠肺泡灌洗液,采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ的含量。
　　結(jié)果:(1)淫羊藿菅對大鼠哮喘模型肺組織病理學和炎癥分級評分影響的結(jié)果顯示:OVA+淫羊藿苷高劑量組支氣管、血管和周圍肺組織有炎性細胞浸

3、潤,支氣管上皮可見部分損傷,與模型組相比較,支氣管上皮和血管周圍的炎癥有所減輕。模型組大鼠肺組織炎癥評分明顯高于正常對照組,OVA+淫羊藿苷高劑量組與模型組相比較,炎癥評分降低,差異有顯著性(P＜0.05);(2)淫羊藿苷對大鼠哮喘模型外周血細胞計數(shù)的影響結(jié)果顯示:模型組外周血總細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞與正常對照組相比較均顯著增加,OVA+淫羊藿苷高劑量組對嗜酸性粒細胞和巨噬細胞抑制明顯,差異有顯著性(P＜0.05);(3)淫羊藿苷

4、對大鼠哮喘模型外周血細胞因子影響的結(jié)果顯示:模型組大鼠血清IL-4、IL-13和TNF-α水平與正常對照組相比較均顯著增加,血清IFN-γ,水平顯著降低。OVA+淫羊藿苷高、中劑量組對哮喘大鼠血清IL-4、IL-13和TNF-α水平抑制明顯,差異具有顯著性(P＜0.05),淫羊藿苷高劑量組能夠增加大鼠哮喘模型血清IFN-γ的表達水平,差異有顯著性(P＜0.05);(4)淫羊藿苷對大鼠哮喘模型肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ表達影響的結(jié)果

5、顯示:模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-4表達明顯高于正常對照組;OVA+淫羊藿苷高劑量組與哮喘模型組相比較,大鼠肺泡灌洗液中IL-4表達明顯降低,差異有顯著性(P＜0.05),哮喘模型組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ表達明顯低于正常對照組,淫羊藿苷治療組與哮喘模型組相比較,大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ表達有所升高,差異有顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)淫羊藿苷具有改善哮喘大鼠肺組織炎癥的作用;(2)淫羊藿苷具有抑制哮喘大鼠外周血嗜

6、酸性粒細胞和巨噬細胞聚集的作用;(3)淫羊藿菅具有抑制哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液中炎癥細胞因子的作用。
　　第二部分，淫羊藿苷對大鼠哮喘性氣道炎癥影響的分子機制研究
　　目的:觀察淫羊藿苷對卵蛋白誘導大鼠Th1／Th2細胞因子失衡表達的影響及機理探討。
　　方法:(1)60只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組(PBS)、模型組(OVA誘導)、地塞米松組、OVA+淫羊藿苷低、中、高劑量組(5、10、20mg/kg-1);(2)

7、采用卵蛋白(OVA)致敏和激發(fā)大鼠建立哮喘模型;(3)采用ELISA法觀察淫羊藿苷對各組大鼠肺組織IL-4和IFN-γ的含量的影響;(4)采用免疫組化染色觀察淫羊藿苷對各組大鼠肺組織T-bet和GATA-3的干預作用;(5)采用RealtimeRT-PCR法觀察淫羊藿苷對各組大鼠肺組織和脾臟淋巴細胞T-bet和GATA-3mRNA表達的干預作用;(6)采用Westernblot法觀察淫羊藿苷對各組大鼠肺組織T-bet、GATA-3和NF

8、-κBp65蛋白表達的干預作用。
　　結(jié)果:(1)各組大鼠肺組織ELISA結(jié)果顯示,OVA+淫羊藿苷中、高劑量組與哮喘模型組相比較,大鼠肺組織IL-4表達明顯降低,差異有顯著性(P＜0.05),大鼠肺組織IFN-γ表達有升高趨勢,但是無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);(2)各組大鼠肺組織GATA-3和T-bet免疫組化染色結(jié)果顯示,OVA+淫羊藿苷高劑量組GATA-3染色明顯減少,T-bet染色沒有明顯減少;(3)各組大鼠肺組織和脾臟

9、淋巴細胞T-bet和GATA-3mRNA表達結(jié)果顯示,淫羊藿苷治療組與哮喘模型組相比較,大鼠肺組織中T-bet和GATA-3mRNA表達明顯降低,差異有顯著性(P＜0.05);哮喘模型組大鼠脾臟淋巴細胞中GATA-3和T-betmRNA表達明顯高于正常對照組,淫羊藿苷治療組與哮喘模型組相比較,大鼠肺組織中GATA-3mRNA表達明顯降低,差異有顯著性(P＜0.05),T-betmRNA表達有所降低,但是差異無顯著性(P＞0.05);(4

10、)各組大鼠肺組織T-bet和GATA-3蛋白表達的結(jié)果顯示,模型組T-bet和GATA-3表達與PBS對照組相比較顯著增加,淫羊藿苷能夠抑制GATA-3蛋白的增加,而對T-bet的抑制作用不明顯;(5)各組大鼠肺組織NF-κBp65免疫組化染色結(jié)果顯示,OVA+淫羊藿苷高劑量組的支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織有炎性細胞浸潤,NF-κBp65著色細胞較少,與模型組相比較,NF-κBp65陽性表達較少;(6)各組大鼠肺組織NF-κBp65蛋

11、白檢測結(jié)果顯示,淫羊藿苷治療組的p65總蛋白的表達減少,胞漿p65蛋白表達增加。
　　結(jié)論:(1)淫羊藿苷能夠調(diào)節(jié)哮喘大鼠肺組織Th1／Th2相關細胞因子表達失衡;(2)淫羊藿苷能夠調(diào)節(jié)哮喘大鼠肺組織和脾臟淋巴細胞中Th1/Th2相關轉(zhuǎn)錄因子(T-bet／GATA-3)表達失衡;(3)淫羊藿苷具有抑制哮喘大鼠肺組織NF-κBp65蛋白激活的作用。
　　第三部分，淫羊藿苷調(diào)控內(nèi)毒素誘導炎癥反應的體內(nèi)及體外實驗研究
　　目

12、的:本研究旨在探討淫羊霍苷在抑制LPS誘導的體內(nèi)和體外炎癥反應中的作用及信號轉(zhuǎn)導機制。
　　方法:(1)肺組織HE染色觀察淫羊藿苷對LPS誘導的急性炎癥的影響;(2)檢測肺組織髓過氧化物酶(MPO)觀察淫羊藿苷對LPS誘導的炎癥反應的影響;(3)ELISA法觀察淫羊藿管對各組小鼠血清細胞因子的抑制作用(TNF-α,PGE2和NO);(4)Real-timeRT-PCR觀察淫羊藿苷對各組小鼠肺組織TNF-α、iNOS和COX-2mR

13、NA表達的影響;(5)Westernblot觀察淫羊藿苷對PI3K／AKT的激活作用;(6)共聚焦和EMSA觀察淫羊藿昔對NF-κBp65激活的抑制作用。
　　結(jié)果:淫羊藿苷(20mg／kg-1)干預后,能抑制LPS誘導的小鼠肺組織TNF-α、IL-6和COX-2mRNA表達的增加;淫羊藿昔能夠降低過氧化物酶(MPO)活性;在RAW264.7細胞中,淫羊藿苷對LPS的細胞毒作用具有保護作用;免疫印跡和共聚焦顯微鏡分析表明,淫羊藿苷