軀干神經嵴干細胞的分離、純化及其向雪旺細胞分化的實驗研究.pdf

1、周圍神經損傷是臨床上的常見病、多發(fā)病。神經損傷后致使支配區(qū)的感覺及運動障礙，常常導致肌肉癱瘓、萎縮，甚至留下終生殘疾。尋找比較理想的治療方法一直是當今創(chuàng)傷外科和康復醫(yī)學等學科的一個研究熱點。近年來，組織工程技術的進展為周圍神經損傷的治療帶來了新的希望，種子細胞的優(yōu)化精選是組織工程技術的關鍵。 雪旺細胞（Schwann cell，SCs）是周圍神經系統(tǒng)的主要結構和功能細胞，起源于神經嵴干細胞。周圍神經損傷后，它既可引導神經軸索的定

2、向生長，又能分泌多種神經營養(yǎng)因子，改善神經再生的微環(huán)境，促進周圍神經再生及其功能恢復，是公認的種子細胞。然而自體來源的SCs在適當條件下難以獲得大量子代雪旺細胞；異體來源的SCs則存在免疫排斥反應等，因此有必要繼續(xù)尋找更為有效的種子細胞。 神經嵴是脊椎動物胚胎早期從神經管背外側遷移出來的位于神經管和外胚層之間的兩條縱向細胞帶。神經嵴細胞能夠進行自我更新，并可分化為神經元、神經膠質細胞、平滑肌樣細胞等多種類型的細胞，也稱為神經嵴干

3、細胞（neural crest stem cell，NCSC）。自軀干部神經管區(qū)域遷移出來的神經嵴干細胞，即軀干神經嵴干細胞（trunk neural crest stem cell，TNCSC），可分化為組成周圍神經系統(tǒng)的絕大部分神經元和膠質細胞，是周圍神經系統(tǒng)的原基，將軀干神經嵴干細胞應用于神經組織工程有著良好的應用前景。研究表明，神經嵴干細胞可以向神經譜系、成骨細胞等多細胞系方向進行分化，但是由于神經嵴干細胞對體外培養(yǎng)的要求比較苛

4、刻，且取得純度較高的細胞存在一定的困難，所以對促使其分化為成熟雪旺細胞的影響因素和機制及雪旺細胞與NCSC之間相互的作用鮮有報道。 探索如何獲取軀干神經嵴干細胞，并增加其向雪旺細胞分化的數量，為組織工程技術提供合適的種子細胞，從而促進周圍神經再生和功能恢復，是目前亟待解決的問題。 基于以上理念，我們設計了本項實驗：取孕10．5dWistar大鼠的胚胎神經管分離，利用軀干神經管植塊法進行培養(yǎng)、純化神經嵴干細胞，行p75和n

5、estin免疫細胞化學雙重染色鑒定培養(yǎng)的軀干神經嵴干細胞，并對其克隆形成能力、增殖、自然分化等生物學特性進行了初步觀察；將傳代的軀干神經嵴干細胞置于雪旺細胞條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)觀察，利用MTT分析、細胞計數、免疫細胞化學染色等方法觀察軀干神經嵴干細胞存活、增殖、定向分化為功能性雪旺細胞的情況，旨在通過體外培養(yǎng)獲得足夠量的雪旺細胞，為細胞移植修復周圍神經損傷提供實驗依據。 本實驗結果顯示，軀干神經管植塊培養(yǎng)貼壁24h后可見細胞自組織塊

6、邊緣遷出，48h后細胞以神經管組織為中心里輻射狀分布，形態(tài)多為梭形，少量呈多角形，胞體豐滿，胞核較大，免疫細胞化學染色結果顯示，神經嵴干細胞的特異性抗體-低親和力神經生長因子受體的抗體p75及神經巢蛋白nestin染色陽性，表明培養(yǎng)的細胞為軀干神經嵴干細胞。生長曲線計算結果顯示軀干神經嵴干細胞的倍增時間為34．2h，細胞呈克隆性生長；在10％血清誘導下，軀干神經嵴干細胞自然分化為神經元、神經膠質細胞和平滑肌樣細胞，免疫細胞化學染色顯示細

7、胞分別呈MAP2、GFAP、α-SMA陽性。將傳代的軀干神經嵴干細胞球在雪旺細胞條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)24h后細胞貼壁，約36h可見細胞遷出，部分細胞胞體較飽滿，突起細長，大體形態(tài)與成熟神經元相似；部分細胞有二個或三個突起，呈梭形，形態(tài)類似雪旺細胞。隨著培養(yǎng)時間延長，突起束狀排列，顯微鏡觀察可見在神經元的軸突局部呈雙軌樣結構，也有少數多個突起的細胞胞體呈不規(guī)則形。對照組中神經嵴干細胞球貼壁較少，細胞生長狀況較差，隨培養(yǎng)時間延長遷出的細胞逐

8、漸減少，形態(tài)變化不大，至培養(yǎng)1周，細胞大多死亡。通過細胞免疫熒光染色和圖像分析觀察到在雪旺細胞條件培養(yǎng)液中，軀干神經嵴干細胞分化的神經元與膠質細胞比例為0．75：1，可分化為大量的神經膠質細胞。MTT分析顯示：軀干神經嵴干細胞在條件培養(yǎng)液中存活及增殖活性顯著增加（P<0．01）。培養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn)部分軸突局部出現(xiàn)陽性表達MBP，表明分化形成的神經膠質細胞向成髓鞘雪旺細胞方向分化。 結論：本實驗成功分離培養(yǎng)了軀干神經嵴干細胞并探討了其