呼吸道合胞病毒感染啟動(dòng)氣道重塑的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：本研究為系列研究的組成部分，該系列研究的早期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)RSV感染人氣道上皮細(xì)胞與上皮下人原代支氣管成纖維細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)時(shí)可上調(diào)HPBFs白三烯C4合成酶表達(dá)并促進(jìn)CysLTs、TGF-β1和ET-1合成，白三烯調(diào)節(jié)劑孟魯司特對此過程有明顯抑制作用。綜上所述，推測RSV感染人氣道上皮細(xì)胞可能通過上調(diào)CysLTs的表達(dá)與分泌從而啟動(dòng)氣道重塑的過程。但目前缺乏RSV感染人氣道上皮細(xì)胞對上皮下間充質(zhì)細(xì)胞增生轉(zhuǎn)化和ECM分泌水平影響的

2、研究。另外，要系統(tǒng)研究RSV感染相關(guān)喘息的分子生物學(xué)機(jī)制，必須成功建立RSV感染人氣道上皮細(xì)胞的體外模型，但目前尚無公認(rèn)的RSV感染人氣道上皮細(xì)胞體外模型。
　　 目的: 1.通過系列觀察RSV不同感染復(fù)數(shù)和不同感染時(shí)間感染16-HBE的細(xì)胞病變改變，探討RSV感染16-HBE最佳條件以成功建立RSV感染16-HBE的體外模型，為進(jìn)一步系統(tǒng)探討RSV感染分子生物學(xué)機(jī)制提供有效的體外研究細(xì)胞模型；2.通過RSV感染人氣道上皮細(xì)胞與

3、上皮下間充質(zhì)細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)模型，觀察RSV感染16-HBE對HPBFs向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化及其ECM分泌水平的影響，了解RSV感染氣道上皮細(xì)胞能否啟動(dòng)氣道重塑過程，引起氣道慢性組織病理學(xué)改變，以期探討嬰幼兒RSV-LRTI引起慢性持續(xù)性哮喘的相關(guān)機(jī)制；3.同時(shí)觀察常用的哮喘長期控制藥物吸入糖皮質(zhì)激素及白三烯調(diào)節(jié)劑對RSV感染氣道上皮細(xì)胞促進(jìn)上皮下間充質(zhì)細(xì)胞增生轉(zhuǎn)化和ECM分泌過程可能存在的抑制作用，為RSV感染誘發(fā)的喘息和兒童哮喘有效早期預(yù)

4、防藥物的選擇提供理論依據(jù)。
　　 方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)和RSV傳代、凍存、定量：培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所需的人喉癌上皮細(xì)胞株、16-HBE和HPBFs。以RSV易感的Hep-2進(jìn)行病毒的繁殖、傳代、凍存，空斑技術(shù)測定病毒感染單位量。2.RSV感染16-HBE體外模型的建立：16-HBE細(xì)胞以104/ml分種于96孔培養(yǎng)板，50ul/孔待細(xì)胞70％匯合后，動(dòng)態(tài)觀察接種24h、48h、72h、96h、120h后16-HBE細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞增殖活

5、性實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性，并以RT-PCR法檢測16-HBE細(xì)胞中RSV病毒核酸和直接免疫熒光技術(shù)察知病毒相應(yīng)抗原在感染細(xì)胞內(nèi)的定位。3.RSV感染16-HBE對HPBFs向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響：HPBFs以1x105/well接種于放入一小玻片的6孔板，同時(shí)16-HBE細(xì)胞以大致相同的密度接種于培養(yǎng)小室，以MOI為0.1的RSV接種于16-HBE，吸附2小時(shí)將培養(yǎng)小室放入培養(yǎng)有HPBFs的6孔板中。實(shí)驗(yàn)分16-HBE-RSV+HPBF

6、s組和16-HBE+HPBFs組，復(fù)合培養(yǎng) 24h、48h、72h、96h和120h，于各時(shí)間點(diǎn)收集6孔板中的HPBFs和上清液，應(yīng)用間接免疫熒光法和蛋白免疫印跡檢測α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平，應(yīng)用競爭性酶連免疫吸附試驗(yàn)檢測上清液Ⅰ型膠原和纖維結(jié)合蛋白的分泌水平。4.BUD對RSV感染16-HBE促進(jìn)HPBFs向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程的影響：HPBFs以1x105/well接種于放入一小玻片的6孔板，同時(shí)16-HBE細(xì)胞以大致相同的密度

7、接種于培養(yǎng)小室，以MOI為0.1的RSV接種于16-HBE，吸附2小時(shí)將培養(yǎng)小室放入培養(yǎng)有HPBFs的6孔板中。實(shí)驗(yàn)分組：16-HBE+HPBFs組、16-HBE-RSV+HPBFs組、16-HBE-RSV+HPBFs+BUD組、16-HBE-RSV+HPBFs+BUD 組和16-HBE-RSV+HPBFs+BUD 組，復(fù)合培養(yǎng)72h后收集6孔板中的上清液和細(xì)胞，檢測細(xì)胞α-SMA的表達(dá)水平和上清液中ColⅠ的分泌水平。5.Mont對R

8、SV感染16-HBE促進(jìn)HPBFs向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程的影響：HPBFs以1x105/well接種于放入一小玻片的6孔板，同時(shí)16-HBE細(xì)胞以大致相同的密度接種于培養(yǎng)小室，以MOI為0.1的RSV接種于16-HBE，吸附2小時(shí)將培養(yǎng)小室放入培養(yǎng)有HPBFs的6孔板中。實(shí)驗(yàn)分組：16-HBE+HPBFs組、16-HBE-RSV+HPBFs組、16-HBE-RSV+HPBFs+Mont組、16-HBE–RSV+HPBFs+Mont組和1

9、6-HBE-RSV+HPBFs+Mont組，復(fù)合培養(yǎng)72h后收集6孔板中的上清液和細(xì)胞，檢測細(xì)胞α-SMA的表達(dá)水平和上清液中ColⅠ的分泌水平。
　　 結(jié)果:1.RSV感染16-HBE體外模型的建立：MOI為0.1組接種72h后16-HBE的GI為0.85，即死亡細(xì)胞不多，與未感染對照組相比85％細(xì)胞仍為活細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下觀察見細(xì)胞胞體增大，透亮度降低，小部分細(xì)胞呈壞死聚集狀，直接免疫熒光技術(shù)能檢測到病毒抗原在胞漿內(nèi)表達(dá)，P

10、CR技術(shù)能從16-HBE提取的總RNA中擴(kuò)增出RSV病毒核酸的基因片段，證實(shí)RSV成功感染16-HBE，且MOI為0.1和感染時(shí)間為72h是RSV感染16-HBE最佳條件。2.RSV感染16-HBE對HPBFs向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響：在24h和48h時(shí)，16-HBE-RSV+HPBFs組和16-HBE+HPBFs組未見α-SMA的表達(dá)，從72h開始兩組均有不同程度的α-SMA表達(dá)，96h表達(dá)水平最高。16-HBE-RSV+HPBFs組

11、在72h、96h和120h時(shí)α-SMA的表達(dá)水平均顯著高于16-HBE+HPBFs組。在24h、48h、72h、96h和120h時(shí)，16-HBE-RSV+HPBFs組ColⅠ的分泌水平均明顯高于16-HBE+HPBFs組,而且隨復(fù)合培養(yǎng)時(shí)間的增加，ColⅠ分泌水平也逐漸增加，120h的分泌水平最高，顯著高于24h、48h、72h和96h。在24h、48h、72h、96h和120h時(shí)，16-HBE-RSV+HPBFs組Fn的分泌水平與16

12、-HBE+HPBFs組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩組各時(shí)間段比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.BUD對RSV感染16-HBE促進(jìn)HPBFs向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響: 16-HBE-RSV+HPBFs組α-SMA的表達(dá)水平明顯高于16-HBE+HPBFs組。16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10-8)組、16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10-6)組和16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10-5)組α-SMA的表達(dá)水平與16-HBE

13、-RSV+HPBFs組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異。16-HBE-RSV+HPBFs組ColⅠ的分泌水平明顯高于16-HBE+HPBFs組。16-HBE-RSV+HPBFs+BUD (10-8)組、16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10-6)組和16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10-5)組ColⅠ的分泌水平與16-HBE-RSV+HPBFs組之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（t分別為2.365、3.594和4.061，P均>0.0

14、5）。4.Mont對RSV感染16-HBE促進(jìn)HPBFs向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響:16-HBE-RSV+HPBFs組α-SMA的表達(dá)水平明顯高于16HBE+HPBFs組（t為36.957，P<0.05）。16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-7)組、16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-6)組和16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-5)組α-SMA的表達(dá)水平明顯低于16-HBE-RSV+HPBFs組(

15、t分別為22.583、63.316和159.96，P均<0.05)。16-HBE-RSV+HPBFs組ColⅠ的分泌水平明顯高于16-HBE+HPBFs組（t為101.817，P<0.05）。16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-7)組、16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-6)組和16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10-5)組ColⅠ的分泌水平明顯低于16-HBE-RSV+HPBFs組(t分別為12.

16、846、26.522和28.418，P均<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1．RSV可成功感染16-HBE，但受RSV感染的16-HBE僅出現(xiàn)細(xì)胞胞體增大，透亮度降低，壞死細(xì)胞增多呈聚集狀，不形成典型融合病變，MOI為0.1和感染時(shí)間為72h是RSV感染16-HBE最佳條件；
　　 2．RSV感染人氣道上皮細(xì)胞與上皮下成纖維細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)時(shí)可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)ColⅠ的分泌，從而啟

17、動(dòng)氣道重塑的過程。
　　 3．白三烯調(diào)節(jié)劑孟魯司特能有效抑制RSV感染人氣道上皮細(xì)胞促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化并增加細(xì)胞外基質(zhì)ColⅠ分泌的過程，提示CysLTs在RSV相關(guān)喘息及其啟動(dòng)氣道重塑中起重要作用。
　　 4．吸入糖皮質(zhì)激素BUD不能有效抑制RSV感染人氣道上皮細(xì)胞促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化并增加細(xì)胞外基質(zhì)ColⅠ分泌的過程，這可能是糖皮質(zhì)激素對嬰幼兒RSV感染相關(guān)喘息療效不明確的原因。