脊髓和外周MK-801對(duì)formalin引起的大鼠脊髓P38MAPK活化的影響.pdf

1、福爾馬林實(shí)驗(yàn)被廣泛用于痛機(jī)制的研究及鎮(zhèn)痛藥的篩選。皮下注射福爾馬林引起的傷害性神經(jīng)沖動(dòng)經(jīng)初級(jí)傳入Aδ和/或C纖維傳入脊髓背角，引起谷氨酸、P物質(zhì)等興奮性遞質(zhì)的釋放，這些遞質(zhì)與其受體結(jié)合后，參與傷害性信息的傳遞。MAPKs是絲氨酸激酶，在細(xì)胞膜到核內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵的作用。p38 MAPK是MAPK家族中的一組酶，通過一系列物理或化學(xué)刺激被激活，即被磷酸化。大量的研究表明，p38 MAPK通過對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、受體表達(dá)等的調(diào)節(jié)，在神

2、經(jīng)元可塑性變化及痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。本研究室及其他研究者的觀察都證實(shí)外周和脊髓NMDA受體在福爾馬林引起的痛模型中發(fā)揮重要的作用。NMDA受體拮抗劑MK-801能顯著降低福爾馬林實(shí)驗(yàn)的痛行為。但在福爾馬林痛實(shí)驗(yàn)中激動(dòng)的NMDA受體是否也通過活化脊髓p38 MAPK發(fā)揮作用，未見相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)在外周注射福爾馬林的基礎(chǔ)上，通過行為學(xué)觀察和功能形態(tài)學(xué)的方法，結(jié)合鞘內(nèi)或外周給予NMDA受體拮抗劑MK-80l，試圖證實(shí)NMDA受體對(duì)大

3、鼠脊髓p38 MAPK活化的影響。 實(shí)驗(yàn)在Wistar雄性大鼠(100～120g)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)分為兩部分， 第一部分是通過中樞給予MK-801觀察中樞NMDA受體對(duì)大鼠脊髓p38 MAPK活化的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組。第一組是福爾馬林+生理鹽水組(n=6)，第二組是福爾馬林+MK-801組.根據(jù)MK-801(Sigma)的注射劑量，將福爾馬林+MK-801組進(jìn)一步分為10nmol、50nmol和100nmol(n=6)三

4、個(gè)亞組。各組大鼠均于左后腳掌面皮下注射5％福爾馬林50ul后立即進(jìn)行行為學(xué)觀察，以大鼠舔咬注射側(cè)腳掌作為痛反應(yīng)的觀察指標(biāo)。預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，formalin腳掌注射對(duì)p38表達(dá)量沒有影響，但卻增加了p38的磷酸化，formalin注射后5分鐘開始出現(xiàn)，20分鐘達(dá)高峰，之后逐漸下降，45分鐘恢復(fù)正常。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，我們以20分鐘的P-p38作為過程對(duì)照，觀察鞘內(nèi)給予NMDA受體拮抗劑MK-801之后P-p38的活化情況。在formalin注射

5、前15分鐘鞘內(nèi)給予NS作為對(duì)照或MK-801(10、50、100nmol)，之后在formalin注射后20分鐘，取出動(dòng)物腰膨大部位進(jìn)行Western blot檢測(cè)。 第二部分是通過外周注入MK-801觀察外周NMDA受體在福爾馬林引起的脊髓p38活化中的作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組。第一組是福爾馬林+生理鹽水組(n=6)，第二組是福爾馬林+MK-801組.根據(jù)MK-801(Sigma)的注射劑量，將福爾馬林+MK-801組進(jìn)一步分為

6、50nmol、100nmol和150nmol(n=6)三個(gè)亞組。各組大鼠均于左后腳掌面皮下注射5％福爾馬林50ul后立即進(jìn)行行為學(xué)觀察，以大鼠舔咬注射側(cè)腳掌作為痛反應(yīng)的觀察指標(biāo)。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，在formalin注射后20分鐘，取出動(dòng)物腰膨大部位進(jìn)行Western blot檢測(cè)。 結(jié)果顯示，在第一部分實(shí)驗(yàn)中，MK-801組與對(duì)照組相比，MK-801組僅在大劑量(50、100nmol)時(shí)對(duì)第一時(shí)相舔咬注射側(cè)腳掌有抑制作用；而對(duì)第二

7、時(shí)相舔咬注射側(cè)腳掌，各個(gè)劑量的MK-801均有顯著的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示，對(duì)照組的第二時(shí)相舔咬時(shí)間為127.00±17.78s，而在MK-801組分別為65.8±13.37s、60.8±16.90s和39.6±4.16s與對(duì)照組相比均有顯著性(均為P<0.05)。在隨后的Western blot檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)給予MK-801之后，可以抑制formalin注射后誘導(dǎo)的P-p38的活化增加，并呈現(xiàn)劑量依賴性。數(shù)據(jù)顯示，P-p38在對(duì)照組中為

8、100.00±0.00，而在MK-801組分別為70.49±7.37、40.89±6.6和19.35±4.48，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(均為P<0.05)。 在第二部分的實(shí)驗(yàn)中，腳掌注入MK-801在較大的劑量(100、150nmol)時(shí)對(duì)第一時(shí)相舔咬注射側(cè)腳掌有抑制作用。數(shù)據(jù)顯示，對(duì)照組第一時(shí)相舔咬時(shí)間為97.4±7.14s，而在MK-801組僅在大劑量(100、150nmol)有抑制作用。對(duì)照組第二時(shí)相舔咬時(shí)間為258±

9、16.54s，而在MK-801組分別為230.2±36.67s、139.8±7.85s和90±19.97s與對(duì)照組相比均有顯著性(均為P<0.05)。Western blot檢測(cè)顯示，MK-801在較大的劑量(100、150nmol)時(shí)對(duì)活化的P-p38有抑制作用。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果如下： 1.大鼠腳掌注射福爾馬林可以同時(shí)引起大鼠的痛行為反應(yīng)和脊髓背角P-p38的活化。 2.腳掌注射福爾馬林引起的痛行為

10、反應(yīng)包括兩個(gè)時(shí)相。脊髓和外周NMDA受體拮抗劑MK-801.可以明顯減弱注射福爾馬林引起的痛行為反應(yīng)，尤其是第二時(shí)相的痛行為反應(yīng)。 3.腳掌注射福爾馬林對(duì)p38表達(dá)量沒有影響，但卻增加了p38的磷酸化，formalin注射后5分鐘開始出現(xiàn)，20分鐘達(dá)高峰，之后逐漸下降，45分鐘恢復(fù)正常。 4.鞘內(nèi)給予MK-801之后，可以抑制formalin注射后誘導(dǎo)的P-p38的活化增加，并呈現(xiàn)劑量依賴性；外周給予MK-801之后，在