天然CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞體外擴增及誘導型調(diào)節(jié)性T細胞的體外誘導初步研究.pdf

1、CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T Cellls,Treg)是天然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細胞的重要亞群之一,在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。近年來越來越多的證據(jù)證明,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞在維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、腫瘤免疫監(jiān)測及自身免疫性疾病的發(fā)生中均發(fā)揮重要作用。但是機體內(nèi)天然的Treg細胞數(shù)目很少,在人體內(nèi),Treg細胞占CD4+T細胞的5％～10%,而小鼠的只占1%～2%。因此,必須建立有效的T

2、reg細胞體外擴增方法,才能滿足大量的臨床輸注需要。
　　目前,普遍利用anti-CD3、CD28單克隆抗體和外源IL-2體外擴增Treg細胞,但其擴增效率很低,不能滿足臨床需求。此外,通過與DC的共培養(yǎng)也能達到擴增Treg細胞的效果。Treg細胞不僅在胸腺中產(chǎn)生,也可以在外周誘導生成。研究表明,TGF-β在Foxp3+誘導型Treg細胞(induced Treg,iTreg)的誘導、擴增和抑制功能中發(fā)揮了重要作用。本實驗應(yīng)用免疫

3、磁珠分離純化C57BL/6小鼠的CD4+CD25+T細胞,采用同基因及異基因不同種類的DC在體外擴增Treg細胞,通過流式細胞術(shù)和T細胞增殖抑制實驗檢測擴增前后Treg細胞表型和功能。
　　此外,本實驗采用TGF-β、IL-2和anti-CD3/CD28單克隆抗體誘導生成iTreg細胞,并驗證其表型和功能。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),MACS分離的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞純度達到93.57%,同基因和異基因DC都能有效刺激Treg細胞體外

4、擴增,其中同基因成熟DC擴增效果最為明顯。同基因成熟DC擴增后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞純度達到94.16%,且高表達Foxp3分子。當CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞與效應(yīng)T細胞比例為1∶1時,能夠有效的抑制效應(yīng)T細胞的增殖,而且,同基因成熟DC擴增的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的抑制效果比新分離的Treg效果更好。
　　由此可見,同基因成熟DC能夠體外擴增表型和功能穩(wěn)定的Treg細胞。MACS分離純化的小鼠CD4+CD25

5、-T細胞低表達Foxp3分子,為17.62%,與Treg細胞功能相關(guān)的分子CTLA-4和CD62L表達也比較低,分別為1.37%和73.61%。經(jīng)TGF-β、IL-2和anti-CD3/CD28單克隆抗體體外誘導5天后,其Foxp3的表達上調(diào)至98.70%,而且其功能性分子CTLA-4和CD62L的表達也分別達到72.1%和87.51%。T細胞增殖抑制實驗結(jié)果表明,iTreg細胞與效應(yīng)T細胞比例為0.5∶1和1∶1時,能夠有效的抑制T細