23kD肝再生增強因子對人腎小管上皮細胞自噬水平的調節(jié)作用.pdf

1、第一部分、構建穩(wěn)定下調23kD肝再生增強因子表達的人腎小管上皮細胞株
　　目的：通過慢病毒感染人腎小管上皮細胞（HK-2）及嘌呤篩選的方法，構建穩(wěn)定下調23kD肝再生增強因子（augmenter of liver regeneration，ALR）表達的人腎小管上皮細胞株。
　　方法：設計針對人ALR基因的siRNA干擾靶點序列，構建特異性干擾人ALR表達的慢病毒shRNA/ALR，轉染人腎小管上皮細胞（HK-2）細胞。慢病

2、毒shRNA/control轉染HK-2細胞作為對照。通過不同濃度嘌呤霉素對HK-2細胞進行處理，確定嘌呤霉素的篩選濃度。通過實時熒光定量PCR及免疫印跡法檢測人腎小管上皮細胞中23kD ALR的表達情況。MTS檢測HK-2細胞的增殖能力。
　　結果：序列對比確認慢病毒中ALR siRNA寡核苷酸序列插入正確，嘌呤篩選濃度確認為3μg/ml。實時熒光定量PCR及免疫印跡檢測顯示，與正常組及shRNA/control對照組比較，sh

3、RNA/ALR組細胞內源性23kD ALR mRNA水平及蛋白表達顯著減少（P＜0.05）。MTS結果顯示，下調23kD ALR表達對HK-2細胞的增殖無明顯影響（P＞0.05）。
　　小結：成功構建了穩(wěn)定下調23kD ALR表達的HK-2細胞株。
　　第二部分、I/R處理對HK-2細胞23kD ALR表達及自噬水平的影響
　　目的：了解體外缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）處理對HK-2細

4、胞23kD ALR表達及自噬相關蛋白表達的影響。
　　方法：采用無糖無血清培養(yǎng)基結合缺氧復氧的方法對HK-2細胞進行處理。通過免疫印跡法檢測HK-2細胞中23kD ALR表達變化及自噬相關蛋白LC3II及p62表達變化。免疫熒光觀察HK-2細胞中LC3熒光光點表達情況。
　　結果：免疫印跡實驗證實I/R處理后HK-2細胞內23kD ALR表達升高，后逐漸降至正常。在I/R處理后3、6、12、24小時自噬相關蛋白LC3II表達

5、均明顯升高，自噬底物蛋白p62表達下降，免疫熒光結果提示I/R處理后HK-2細胞中LC3熒光明顯增強。
　　小結：在I/R過程中HK-2細胞ALR表達先升高，后恢復正常。HK-2細胞自噬水平先升高，后有所降低，但仍高于正常，體外I/R模型構建成功。
　　第三部分、下調23kD ALR表達對缺血再灌注誘導的HK-2細胞自噬水平的影響
　　目的：探討下調23kD ALR表達對缺血再灌注誘導人腎小管上皮細胞自噬水平的影響并探

6、討其作用機制。
　　方法：用無糖無血清培養(yǎng)基結合缺氧復氧的方法對HK-2細胞進行處理，誘導HK-2細胞自噬。慢病毒shRNA/ALR轉染HK-2細胞下調了細胞中23kD ALR的表達。免疫印跡法檢測ALR及自噬相關蛋白LC3II，p62，p-AMPK，AMPK，p-mTOR，mTOR，凋亡蛋白caspase-3的變化情況。激光共聚焦顯微鏡檢測HK-2細胞LC3熒光的表達。流式細胞儀檢測細胞內活性氧（reactive oxygen，

7、ROS）水平。電鏡檢測HK-2細胞自噬小體的形成情況。流式細胞儀分析細胞凋亡水平。
　　結果：免疫印跡法檢測及熒光顯微鏡結果顯示，與shRNA/control對照組比較，shRAN/ALR組細胞自噬水平在I/R后明顯增高，細胞內自噬小體增多，細胞ROS水平顯著增加。與shRNA/control組相比，shRNA/ALR組在缺血再灌注6小時（R6H）p-AMPK升高，p-mTOR降低。予以 AMPK抑制劑 Compound C對HK