針對(duì)PTN重組慢病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)在小細(xì)胞肺癌基因治療中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建針對(duì)多效蛋白（pleiotrophin，PTN）基因的小干涉RNA（siRNA）慢病毒表達(dá)載體并觀察其對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞株P(guān)TN表達(dá)抑制及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響。同時(shí)觀察PTN基因沉默后，人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞中與血管新生、腫瘤生長(zhǎng)、侵襲過(guò)程相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、angiomotin（Amot）、schlafen5（Slfn5）和金屬蛋白酶9（MMP-9）4種基因的表達(dá)變化。構(gòu)建人小細(xì)胞肺癌H446

2、細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型，觀察PTN基因RNA干擾病毒對(duì)移植瘤瘤體生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 方法：利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot方法檢測(cè)PTN在H446細(xì)胞中的表達(dá)。設(shè)計(jì)四對(duì)針對(duì)PTN基因的小發(fā)夾RNA（shRNA）序列，與Plvthm載體連接，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體LV（lentiviral）-shPTN，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。再用LV-shPTN與pRsv-REV、pM

3、Dlg-pRRE、pMD2G三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，小量包裝與純化產(chǎn)生慢病毒顆粒。病毒感染H446細(xì)胞后，用熒光定量PCR及Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中PTN基因的表達(dá)。選擇對(duì)PTN基因干擾效率最高的候選慢病毒載體進(jìn)行大量包裝、純化及病毒滴度測(cè)定。將獲得的病毒感染H446細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為正常未干擾細(xì)胞組、感染空對(duì)照病毒的陰性對(duì)照組、感染PTN基因RNA干擾病毒抑制組、化療組及感染PTN基因RNA干擾病毒抑制加化療組。采用

4、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀（FCM）分析細(xì)胞凋亡。RT-PCR檢測(cè)未干擾細(xì)胞組、陰性對(duì)照組、PTN抑制組和PTN抑制加化療組細(xì)胞中Amot、Slfn5、MMP-9和VEGF的表達(dá)。采用H446細(xì)胞直接皮下接種的方法構(gòu)建人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞裸鼠異種移植瘤動(dòng)物模型，分為正常未干擾組，化療（順鉑）組，干擾PTN的病毒組，化療+干擾PTN的病毒組和陰性病毒對(duì)照組。瘤體附近多點(diǎn)皮下注射病毒或順鉑后，分別于第1、2、

5、7、15天測(cè)量瘤體體積。并在治療第15天分別用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)正常未干擾組、陰性病毒對(duì)照組及干擾PTN的病毒組中PTN的表達(dá)。
　　 結(jié)果：RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果均表明，PTN基因在H446細(xì)胞中表達(dá)顯著高于H460細(xì)胞。構(gòu)建的慢病毒載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。所構(gòu)建的shRNA序列（GCAGCTGTGGATACTGCTGAA）對(duì)PTN mRNA的抑制效率為72％，對(duì)PTN蛋白的抑制

6、效率為59.2％。大量包裝與純化后病毒滴度為1×108 TU/ml。PTN基因抑制組的H446細(xì)胞活力顯著低于正常未干擾組和陰性對(duì)照組細(xì)胞，基因抑制聯(lián)合化療組較單純基因抑制組及化療組細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡率增高，并具呈濃度依賴性。PTN基因沉默后，H446細(xì)胞中Slfn5和MMP-9的表達(dá)分別較陰性對(duì)照組上調(diào)了165.1％和47.3％，而Amot和VEGF的表達(dá)分別較陰性對(duì)照組下調(diào)了33.1％和26.6％。協(xié)同化療后，上述趨勢(shì)更為明顯。

7、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)瘤體組織中干擾PTN病毒組PTN mRNA和PTN蛋白的表達(dá)明顯低于正常未干擾組及陰性病毒對(duì)照組，抑制率為分別為39％及28％。干擾PTN病毒組瘤體體積顯著小于正常未干擾組及陰性病毒對(duì)照組，若協(xié)同化療則瘤體縮小更明顯。
　　 結(jié)論：構(gòu)建PTN RNA干涉載體，轉(zhuǎn)染后可有效降低H446細(xì)胞PTN的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，抑制H446細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡，并可進(jìn)一步影響H446細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)變化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示針對(duì)PTN