oxLDL和oxHDL對C57BL-6J小鼠骨髓源性樹突狀細胞趨化作用和成熟活化的影響.pdf

1、目的: 樹突狀細胞（DCs）是體內(nèi)唯一能夠激活初始T細胞的抗原提呈細胞，它是免疫反應(yīng)的樞紐。動脈粥樣硬化（As）是一種脂質(zhì)相關(guān)的慢性免疫炎癥性疾病。近年來研究顯示，DCs可能影響As的起始和進展。已證明多種與As相關(guān)的抗原物質(zhì)可誘導(dǎo)DCs的成熟，而DCs的成熟是其作用完全發(fā)揮的必要條件。本實驗從C57BL/6J小鼠骨髓中分離培養(yǎng)DCs，研究LDL和HDL發(fā)生氧化后，對DCs趨化作用和成熟活化的影響；確定oxLDL和oxHDL作為

2、自身抗原，引起DCs的遷移和成熟活化，導(dǎo)致局部的免疫反應(yīng)和As的起始。 方法: 頸椎脫位法處死C57BL/6J小鼠，取股骨和脛骨，剔除周圍肌肉，離斷干骺端后，用注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，獲得單細胞懸液。利用動物樹突狀細胞專用分離液和細胞黏附性差異去除大部分巨噬細胞和淋巴細胞，用rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo)單個核細胞向DCs分化，并抑制淋巴細胞生長。隔天半量換液，補足所需細胞因子和培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第

3、7天，輕輕吹打收獲，即為未成熟的骨髓源性樹突狀細胞(BMDCs)。從形態(tài)學(xué)、分子標志表達和抗原提呈功能三方面聯(lián)合鑒定：（1）光鏡觀察BMDCs生長過程中形態(tài)變化；掃描電鏡拍攝成熟和未成熟BMDCs的形態(tài)；并粗略計數(shù)具有突起樣細胞的百分比；（2）免疫熒光和流式細胞術(shù)聯(lián)合檢測3種以上的BMDCs表面標志物的表達；（3）混合淋巴細胞反應(yīng)（MLR）反映BMDCs提呈抗原的能力。用濃度分別為50μg/ml的oxLDL和oxHDL處理BMDCs，同

4、時設(shè)立同源蛋白的對照（分別為50μg/ml LDL和50μg/ml HDL）和陰性（PBS）、陽性對照（1μg/ml LPS）。采用Transwell遷移系統(tǒng)，觀察各實驗組處理因素對BMDCs趨化作用的影響；流式細胞術(shù)檢測各實驗組BMDCs CD86和MHCⅡ的表達率；液體閃爍計數(shù)檢測各實驗組BMDCs刺激同源的性T細胞增殖的能力；將獲得的各組BMDCs注射到C57BL/6J小鼠腹腔，流式細胞術(shù)檢測遷移到脾臟的BMDCs數(shù)目，體內(nèi)間接證

5、明各處理因素對BMDCs成熟的影響。 結(jié)果: C57BL/6J小鼠骨髓單個核細胞在rmIL-4和rmGM-CSF刺激下，符合DCs生長的一般規(guī)律，即從第3天開始，細胞形態(tài)變?yōu)閳A形或者類圓形，半貼壁，呈“葡萄串”或者呈簇生長；其中還可見到少量長突起的雜細胞。培養(yǎng)至第7天，大量細胞出現(xiàn)類圓形或者不規(guī)則形態(tài)。以LPS刺激成熟后，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)細胞突起更加明顯，免疫熒光發(fā)現(xiàn)表達33D1和CD11c的細胞數(shù)均達到80％以上；流式細胞

6、術(shù)檢測CD86和MHCⅡ的細胞表達率分別為99.0％和32.5％；混合淋巴細胞反應(yīng)提示成熟的BMDCs能明顯刺激同源T細胞的增殖。因此，獲得的細胞基本符合實驗所需。 實驗分為PBS陰性對照組、LDL組、oxLDL組、HDL組、oxHDL組和LPS陽性對照組，采用Transwell遷移系統(tǒng)模擬細胞跨血管壁過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PBS對照組相比，除LDL組外，發(fā)生遷移的細胞明顯增加，氧化修飾性脂蛋白比相應(yīng)的脂蛋白更能趨化BMDCs發(fā)生移

7、動。流式細胞術(shù)檢測CD86和MHCⅡ的表達率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別與LDL、HDL相比，oxLDL、oxHDL能明顯促進CD86（84.7％vs68.7％和90.8％vs73.8％）和MHCⅡ（26.0％vs15.2％和25.9％vs11.4％）表達，但仍低于LPS刺激組（99.0％和32.5％）。同樣，氧化脂蛋白刺激的BMDCs組能更好地促進同源T細胞的增殖(cpm值：992±150.00vs 645±21.17；996.3±212.81v

8、s652±50.59)和細胞因子（IL-12和IL-10）的分泌。而且oxLDL和oxHDL誘導(dǎo)的BMDCs更接近LPS刺激的成熟狀態(tài)，LDL和HDL誘導(dǎo)的BMDCs成熟分子標志和混合淋巴細胞反應(yīng)都明顯低于LPS組，其成熟只能達到一種“半成熟”狀態(tài)。體內(nèi)遷移實驗證實了同樣的結(jié)果，以氧化修飾性脂蛋白處理的BMDCs在24小時內(nèi)遷移到脾臟的細胞數(shù)目更多(細胞百分數(shù)：5％vs2％；8％vs2％)。 結(jié)論: （1）分別與LDL和

9、HDL相比，oxLDL、oxHDL更能趨化C57B/6J小鼠BMDCs向Transwell下室移動，提示氧化性脂蛋白可能直接趨化DCs進入血管內(nèi)膜。 （2）oxLDL、oxHDL處理的C57B/6J小鼠BMDCs ，其CD86和MHCⅡ的表達、混合淋巴細胞反應(yīng)和細胞因子（IL-12和IL-10）分泌都明顯升高；提示氧化性脂蛋白更能促進BMDCs的成熟活化。 （3）將oxLDL、oxHDL處理的BMDCs回輸?shù)紺57B/6