血管緊張素Ⅱ通過改變時鐘基因表達誘導心肌細胞肥大.pdf

1、背景：哺乳動物的大部分生理現(xiàn)象具有內源性的晝夜周期性，如血壓、心率、呼吸、體溫、臟器活動、免疫和神經內分泌活動及細胞分裂、DNA功能等，這是由機體內在的周期性振蕩器調節(jié)的。哺乳動物晝夜節(jié)律的產生和維持與時鐘基因的周期性表達有關。其主要的起博機制為一系列調控時鐘基因(Per，Cry，Bmall等)和時鐘輸出基因的負反饋循環(huán)。其中Bmall基因是最主要的啟動因子，BMAL1蛋白與CLOCK蛋白結合成BMAI1/CLOCK異二聚體，結合到Pe

2、r和Cry基因上的E-box上從而啟動Per和Cry基因的轉錄。哺乳動物晝夜節(jié)律的主要起搏點位于下丘腦視交叉上核(SCN)，它可以自主地表達晝夜時鐘基因。許多外周組織自身也具有時鐘振蕩器，即使在離體狀態(tài)下也能表達時鐘基因，而心臟即為其中之一，發(fā)現(xiàn)許多心血管事件具有晝夜節(jié)律性。已有研究表明心臟時鐘基因的表達也呈節(jié)律性變化，且不依賴于中樞的調控。近來，通過對心血管疾病在生理學和病理學上的晝夜變異的研究，人們對心血管系統(tǒng)中單個細胞中調節(jié)一系列

3、細胞進程的潛在機制產生了濃厚的興趣。 心肌肥厚是常見的心血管疾病之一，是冠心病的易患因素和心力衰竭的前期病變，多種刺激因素例如壓力超負荷，神經應激以及體液因素都可以誘發(fā)心肌肥厚。在諸多的神經體液因素中，血管緊張素Ⅱ在調節(jié)血壓、血流及電解質平衡中發(fā)揮了重要的作用。作為一種促分裂活化因子，血管緊張素Ⅱ可能與心血管疾病例如高血壓以及壓力負荷性心肌肥厚的發(fā)病機理有關，它通過與血管緊張素Ⅰ型受體(AT1)結合激活多種蛋白激酶通路(如ERK

4、，JNK，P38等)。 目的：本實驗建立了肥大心肌細胞模型，研究肥大心肌細胞中Per2和Bmall基因表達及PER2，BMAL1蛋白表達的變化。并研究血管緊張素誘導的肥厚心肌細胞中ERK的節(jié)律性表達及其激活的變化。試圖找出月巴厚心肌細胞中ERK與時鐘基因之間的關系，從而為闡明心肌肥厚的一種可能機制提供基礎。 方法： (1)采用出生3天的乳大鼠做體外心肌細胞培養(yǎng)，將心室取出后剪碎、消化，差速貼壁純化心肌細胞后接種，

5、在5％CO<,2>孵箱中37℃培養(yǎng)72小時。 (2)實驗細胞分三組：血管緊張素Ⅱ組，替米沙坦治療組以及正常組。三組細胞均換不舍FBS的培養(yǎng)液；Ang Ⅱ組在培養(yǎng)基中加入Ang Ⅱ至終濃度10<'-7>M；替米沙坦組換液同時加入終濃度10<'-7>M的替米沙坦，半小時后加入終濃度10<'-7>M的AngⅡ。之后三組細胞每24小時(均在6:00PM)換液并加藥一次，連續(xù)作用3天。 (3)用RT-PCR方法測定三組細胞中At1

6、、At2、Per2和Bmall基因表達的情況。 (4)用Western-Blot法測定三組心肌細胞中AT1、AT2、ERK、phospho-ERK、PER2以及BMAL1蛋白的表達量。 結果： (1)通過測定心肌細胞表面積和總蛋白含量可以確定AngⅡ所致的肥大心肌細胞模型建立成功，而替米沙坦可以拮抗AngⅡ誘導心肌細胞肥大的作用。 (2)由RF-PCR檢測結果可見，At1在肥大的心肌細胞中的表達明顯高于正

7、常心肌細胞，替米沙坦治療組At1的表達與對照組相似；而三組細胞中At2的表達沒有顯著性差異。三組細胞中時鐘基因Per2、Bmall均呈節(jié)律性表達，但肥大心肌細胞組明顯高于其它兩組。 (3)由Westem Blot檢測結果可見，AT1蛋白AngⅡ組中的表達明顯高于其它兩組，而三組心肌細胞中AT2的表達沒有顯著性差異。在肥大心肌細胞中ERK被激活，phospho-ERK的表達顯著增加。三組細胞中BMAL1、PER2蛋白白均呈現(xiàn)出節(jié)律

8、性表達，但是肥大心肌細胞中BMAL1、PER2蛋白平均表達水平高于正常心肌細胞和替米沙坦治療組細胞。 結論： (1)體外培養(yǎng)的心肌細胞內時鐘基因均有表達并表現(xiàn)出節(jié)律性。 (2)PCR及蛋白檢測的結果證實，AngⅡ與AT1R結合后激活心肌細胞內ERK，激活的phospho-ERK可能是通過影響PER2的表達來影響整個心肌細胞內時鐘基因的晝夜節(jié)律性表達，進而引起細胞肥大。以上Ang Ⅱ誘發(fā)的各種變化均可被替米沙坦所抑