血管緊張素Ⅱ通過改變時(shí)鐘基因表達(dá)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大.pdf

1、背景：哺乳動(dòng)物的大部分生理現(xiàn)象具有內(nèi)源性的晝夜周期性，如血壓、心率、呼吸、體溫、臟器活動(dòng)、免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)及細(xì)胞分裂、DNA功能等，這是由機(jī)體內(nèi)在的周期性振蕩器調(diào)節(jié)的。哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律的產(chǎn)生和維持與時(shí)鐘基因的周期性表達(dá)有關(guān)。其主要的起博機(jī)制為一系列調(diào)控時(shí)鐘基因(Per，Cry，Bmall等)和時(shí)鐘輸出基因的負(fù)反饋循環(huán)。其中Bmall基因是最主要的啟動(dòng)因子，BMAL1蛋白與CLOCK蛋白結(jié)合成BMAI1/CLOCK異二聚體，結(jié)合到Pe

2、r和Cry基因上的E-box上從而啟動(dòng)Per和Cry基因的轉(zhuǎn)錄。哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律的主要起搏點(diǎn)位于下丘腦視交叉上核(SCN)，它可以自主地表達(dá)晝夜時(shí)鐘基因。許多外周組織自身也具有時(shí)鐘振蕩器，即使在離體狀態(tài)下也能表達(dá)時(shí)鐘基因，而心臟即為其中之一，發(fā)現(xiàn)許多心血管事件具有晝夜節(jié)律性。已有研究表明心臟時(shí)鐘基因的表達(dá)也呈節(jié)律性變化，且不依賴于中樞的調(diào)控。近來，通過對(duì)心血管疾病在生理學(xué)和病理學(xué)上的晝夜變異的研究，人們對(duì)心血管系統(tǒng)中單個(gè)細(xì)胞中調(diào)節(jié)一系列

3、細(xì)胞進(jìn)程的潛在機(jī)制產(chǎn)生了濃厚的興趣。 心肌肥厚是常見的心血管疾病之一，是冠心病的易患因素和心力衰竭的前期病變，多種刺激因素例如壓力超負(fù)荷，神經(jīng)應(yīng)激以及體液因素都可以誘發(fā)心肌肥厚。在諸多的神經(jīng)體液因素中，血管緊張素Ⅱ在調(diào)節(jié)血壓、血流及電解質(zhì)平衡中發(fā)揮了重要的作用。作為一種促分裂活化因子，血管緊張素Ⅱ可能與心血管疾病例如高血壓以及壓力負(fù)荷性心肌肥厚的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，它通過與血管緊張素Ⅰ型受體(AT1)結(jié)合激活多種蛋白激酶通路(如ERK

4、，JNK，P38等)。 目的：本實(shí)驗(yàn)建立了肥大心肌細(xì)胞模型，研究肥大心肌細(xì)胞中Per2和Bmall基因表達(dá)及PER2，BMAL1蛋白表達(dá)的變化。并研究血管緊張素誘導(dǎo)的肥厚心肌細(xì)胞中ERK的節(jié)律性表達(dá)及其激活的變化。試圖找出月巴厚心肌細(xì)胞中ERK與時(shí)鐘基因之間的關(guān)系，從而為闡明心肌肥厚的一種可能機(jī)制提供基礎(chǔ)。 方法： (1)采用出生3天的乳大鼠做體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)，將心室取出后剪碎、消化，差速貼壁純化心肌細(xì)胞后接種，

5、在5％CO<,2>孵箱中37℃培養(yǎng)72小時(shí)。 (2)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分三組：血管緊張素Ⅱ組，替米沙坦治療組以及正常組。三組細(xì)胞均換不舍FBS的培養(yǎng)液；Ang Ⅱ組在培養(yǎng)基中加入Ang Ⅱ至終濃度10<'-7>M；替米沙坦組換液同時(shí)加入終濃度10<'-7>M的替米沙坦，半小時(shí)后加入終濃度10<'-7>M的AngⅡ。之后三組細(xì)胞每24小時(shí)(均在6:00PM)換液并加藥一次，連續(xù)作用3天。 (3)用RT-PCR方法測(cè)定三組細(xì)胞中At1

6、、At2、Per2和Bmall基因表達(dá)的情況。 (4)用Western-Blot法測(cè)定三組心肌細(xì)胞中AT1、AT2、ERK、phospho-ERK、PER2以及BMAL1蛋白的表達(dá)量。 結(jié)果： (1)通過測(cè)定心肌細(xì)胞表面積和總蛋白含量可以確定AngⅡ所致的肥大心肌細(xì)胞模型建立成功，而替米沙坦可以拮抗AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用。 (2)由RF-PCR檢測(cè)結(jié)果可見，At1在肥大的心肌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正

7、常心肌細(xì)胞，替米沙坦治療組At1的表達(dá)與對(duì)照組相似；而三組細(xì)胞中At2的表達(dá)沒有顯著性差異。三組細(xì)胞中時(shí)鐘基因Per2、Bmall均呈節(jié)律性表達(dá)，但肥大心肌細(xì)胞組明顯高于其它兩組。 (3)由Westem Blot檢測(cè)結(jié)果可見，AT1蛋白AngⅡ組中的表達(dá)明顯高于其它兩組，而三組心肌細(xì)胞中AT2的表達(dá)沒有顯著性差異。在肥大心肌細(xì)胞中ERK被激活，phospho-ERK的表達(dá)顯著增加。三組細(xì)胞中BMAL1、PER2蛋白白均呈現(xiàn)出節(jié)律

8、性表達(dá)，但是肥大心肌細(xì)胞中BMAL1、PER2蛋白平均表達(dá)水平高于正常心肌細(xì)胞和替米沙坦治療組細(xì)胞。 結(jié)論： (1)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞內(nèi)時(shí)鐘基因均有表達(dá)并表現(xiàn)出節(jié)律性。 (2)PCR及蛋白檢測(cè)的結(jié)果證實(shí)，AngⅡ與AT1R結(jié)合后激活心肌細(xì)胞內(nèi)ERK，激活的phospho-ERK可能是通過影響PER2的表達(dá)來影響整個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)時(shí)鐘基因的晝夜節(jié)律性表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞肥大。以上Ang Ⅱ誘發(fā)的各種變化均可被替米沙坦所抑