缺氧條件下A549細(xì)胞促進(jìn)HUVEC遷移及血管形成.pdf

1、研究目的:本研究旨在通過體外建立A549缺氧模型模擬體內(nèi)肺癌的缺氧環(huán)境，直觀觀察缺氧條件下A549細(xì)胞促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)遷移、偽足形成及血管形成情況，揭示了體內(nèi)肺癌組織內(nèi)的缺氧環(huán)境與內(nèi)皮細(xì)胞遷移、偽足形成、血管形成的關(guān)系，是肺癌血管生成過程中的重要環(huán)節(jié)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:A549細(xì)胞在不同氧濃度(21％、2％、0％)條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，通過倒置相差顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài)、MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞增殖、免疫細(xì)

2、胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)HIF-1a蛋白量，并通過比較各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，來確定缺氧模型是否建立成功;隨后取常氧組、缺氧組的A549細(xì)胞上清液按不同的濃度(50ul/ml、100ul/ml、150ul/ml)作用于HUVEC24小時(shí)后，對(duì)照組用培養(yǎng)液代替，采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)方法比較各組HUVEC在不同濃度梯度下的遷移情況;然后根據(jù)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將各組細(xì)胞遷移的最佳上清液濃度作用于HUVEC后，采用微絲綠色熒光染色方法來觀察HUVEC的偽

3、足形成，采用體外HUVEC三維培養(yǎng)技術(shù)在倒置相差顯微鏡下觀察各組HUVEC的血管形成情況，并通過計(jì)數(shù)每視野下管腔樣血管結(jié)構(gòu)的數(shù)量對(duì)各組實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1缺氧對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:1）與常氧組比較，缺氧組A549細(xì)胞數(shù)目增多，貼壁生長(zhǎng)良好，部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見多個(gè)偽足形成（提示:缺氧有利于A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移），而無氧組A549細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞體積縮小，部分細(xì)胞形態(tài)消失，核質(zhì)濃縮，

4、可見少數(shù)細(xì)胞漂浮;2）與常氧組比較，缺氧組的OD值升高(P＜0.05)，而無氧組的OD值明顯降低(P＜0.05);3)與常氧組比較，缺氧組及無氧組細(xì)胞胞漿內(nèi)均有HIF-1a蛋白表達(dá)(P＜0.05)，且缺氧組HIF-1a蛋白表達(dá)較無氧組增加。
　　 2缺氧對(duì)HUVEC遷移及血管形成的影響:1）用各組A549細(xì)胞上清液作用于HUVEC24H后，通過組間及組內(nèi)的比較，對(duì)照組的HUVEC遷移不明顯，且各濃度梯度下HUVEC遷移無明顯區(qū)別

5、，而缺氧上清液干預(yù)組及常氧上清液干預(yù)組的HUVEC有明顯的遷移，并呈濃度依賴性，且前者較后者遷移明顯(P＜0.05);2)與對(duì)照組比較，缺氧組上清液干預(yù)組及常氧組上清液干預(yù)組的HUVEC均可見偽足形成，且前者較后者偽足形成明顯;3）采用體外HUVEC三維培養(yǎng)技術(shù)，在倒置相差顯微鏡下對(duì)每視野下管腔樣血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，其余兩組管腔樣血管結(jié)構(gòu)增多(P＜0.05)，且缺氧A549細(xì)胞上清液干預(yù)組的管腔樣血管結(jié)構(gòu)明顯增多。