核因子-κB信號傳導途徑在特發(fā)性脊柱側凸發(fā)病中的作用及機制研究.pdf

1、[背景]
　　 脊柱側凸是常見的脊柱畸形，通常發(fā)生于青春發(fā)育期，女性多見，若不及時診治，部分病人將會發(fā)展加重，引起軀體嚴重畸形，不但影響心肺功能、導致截癱，還會給患兒心理健康造成嚴重危害。該病發(fā)病率由于診斷手段和標準的差異，一般認為在2％左右。在所有患者中，80％的患者病因不明，被稱之為“特發(fā)性脊柱側凸(Idiopathic Scoliosis，IS)”，由于這種疾病常常發(fā)生于青少年，因此也叫青少年特發(fā)性脊柱側凸(Adolesc

2、ent Idiopathic Scoliosis，AIS)。盡管脊柱側凸臨床上已診治多年，但是發(fā)病機制尚不清楚。針對脊柱側凸的病因，近年來，國內外就其遺傳、生長發(fā)育、神經(jīng)肌肉、激素、結締組織等方向做了大量的研究。尤其是遺傳基因的研究最為熱門，國內外學者在IS的遺傳模式和易感基因方面均取得了一些列的進展，但目前為止，還沒有哪一個研究成果能夠真正被學術界廣泛接受。最近有報道，核因子-kappa B(NF-κB)信號通路在調節(jié)細胞的生長發(fā)育方

3、面、細胞凋亡等方面同樣起著重要作用。該因子是細胞中一個重要的轉錄調節(jié)因子，靜息狀態(tài)下與IκB相結合形成復合體，以無活性狀態(tài)存在于胞漿中。當細胞受到外界因素刺激時，NF-κB暴露出核定位信號(NLS)進入核內，使其具有生物活性。目前研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在褪黑素的合成、調節(jié)等方面均產(chǎn)生作用，并且相互影響，其初步研究符合特發(fā)性脊柱側凸的臨床特征。
　　 [目的]
　　 人們不能完全解釋其確切發(fā)病原因，實際上“脊柱側凸”只是一個癥

4、狀診斷，短期內對該疾病進行病因診斷為時尚早，還需要大量的工作。結合臨床實際觀察特發(fā)性脊柱側凸患者同時具有其他異常的比例也很高，如:神經(jīng)系統(tǒng)異常、生長發(fā)育快速、三尖瓣返流、骨質缺乏等等。因此，本人推測特發(fā)性脊柱側凸可能是一個全身性疾病的局部表現(xiàn)。同時NF-κB在細胞的生長、凋亡以及應激因子的釋放等方面具有重要的調節(jié)作用，如果NF-κB信號通路異常，將導致全身性的異常，這種結果與特發(fā)性脊柱側凸合并的其他表現(xiàn)類似。對褪黑素與核因子κB之間的關

5、系及其調控因素的研究可能是解釋IS發(fā)病機制的突破口。本課題擬在前期工作的基礎上，在分子生物學水平，從信號傳導角度，深入研究核因子κB在特發(fā)性脊柱側凸發(fā)病中的作用、相互關系和機制，不但能進一步加深對特發(fā)性脊柱側凸病因的認識，也可以為臨床從根本上預防特發(fā)性脊柱側凸的發(fā)生發(fā)展提供理論基礎和新的治療策略。本課題研究通過加深對特發(fā)性脊柱側凸發(fā)病機制的了解，找到干擾其發(fā)生發(fā)展的治療手段，如采用靜脈注射NF-κB的反義寡核苷酸抑制NF-κB的活性，以

6、控制特發(fā)性脊柱側凸患者病情的進展，為特發(fā)性脊柱側凸這一頑癥從根本上找到新的有效防治方法。若該類研究成果能最終應用于臨床，將可以降低發(fā)病率，從源頭上控制病情，減輕社會和家庭的負擔，降低醫(yī)療支出，增加生產(chǎn)力和社會效益。
　　 [方法]
　　 1.臨床研究
　　 以特發(fā)性脊柱側凸和非特發(fā)性脊柱側凸患者（如先天性脊柱側凸或神經(jīng)纖維瘤病性脊柱側凸）為對象進行研究。
　　 (1)臨床患者NF-κB活性的檢測:

7、　　 抽血取樣，并于前路和后路手術取脊柱骨（椎板、棘突、椎體終板）和軟組織（椎間盤、各種韌帶、椎旁?。吮?，比較不同類型脊柱側凸患者脊柱兩側的NF-κB濃度及NF-κB p65亞基mRNA表達水平。
　　 (2)觀察臨床患者褪黑素水平及其受體基因表達與NF-κB之間的關系:
　　 包括夜間褪黑素水平檢測以及通過術中取材檢測患者不同部位的褪黑素受體mRNA表達水平，并將結果與NF-κB檢測結果進行綜合分析。
　　

8、 (3)觀察上述檢測結果與患者臨床指標進行相關性分析。
　　 患者的側凸類型（特發(fā)性及非特發(fā)性）、形態(tài)（彎曲發(fā)生的不同部位:胸彎、腰彎、胸腰段彎曲、胸腰椎雙主彎等）、柔韌度、嚴重程度、進展速度等臨床指標進行相關性研究。
　　 2.動物實驗
　　 以雞特發(fā)性脊柱側凸動物模型為研究對象進行研究。
　　 (1)制作動物模型
　　 切除雛雞（孵化3天的小雞）松果體建立特發(fā)性脊柱側凸動物模型;
　　

9、 (2) NF-κB活性及含量的檢測
　　 檢測范圍包括不同時段內白細胞、脊柱骨組織（椎板、棘突、椎體終板）和軟組織（脊髓、椎間盤、各種韌帶、椎旁肌）標本的NF-κB濃度及NF-κB p65亞基mRNA表達水平。
　　 (3)觀察褪黑素水平及其受體基因表達與NF-κB之間的關系:
　　 按照對照組、切除松果體已發(fā)生脊柱側凸和未發(fā)生脊柱側凸的動物進行分組，測量其夜間褪黑素水平檢測以及不同部位的褪黑素受體mRNA表達

10、水平，并將結果與NF-κB檢測結果進行綜合分析。探討褪黑素與NF-κB在雞脊柱側凸發(fā)生中的相互聯(lián)系。
　　 (4)探討NF-κB反義寡核苷酸在調控NF-κB活性中的作用:
　　 以特發(fā)性脊柱側凸的動物模型為研究對象，采用NF-κB反義寡核苷酸干預NF-κB的活性，觀察其調控NF-κB活性的效果。
　　 [結果]
　　 臨床研究
　　 1.臨床患者NF-κB活性的檢測
　　 (1)輕中度(C

11、obb＜60°)IS患者外周血、椎板、椎旁肌中NF-κB活性同非特發(fā)性側凸及正常組相比無明顯差別。
　　 (2)重度(Cobb≥60°)IS患者外周血、椎板中NF-κ B活性同非特發(fā)性側凸及正常組相比無明顯差別;但椎旁肌中NF-κ B活性升高。
　　 (3)RT-PCR進一步驗證:重度(Cobb≥60°)IS患者椎旁肌中NF-κB活性較之非特發(fā)性側凸及正常組升高。
　　 (4)重度(Cobb≥60°)IS患者凹側

12、椎旁肌中NF-κ B活性較凸側高。
　　 2.臨床患者褪黑素水平及其受體基因表達與NF-κB之間的關系
　　 (1)輕中度(Cobb＜60°)IS患者外周血、椎板、椎旁肌中褪黑素水平同非特發(fā)性側凸及正常組相比無明顯差別。
　　 (2)重度(Cobb≥60°)IS患者外周血、椎旁肌中褪黑素濃度較之非特發(fā)性側凸及正常組低;但在椎板中無明顯差異。
　　 (3)Western-blot驗證進一步說明:重度(Cob

13、b≥60°)IS患者椎旁肌中褪黑素濃度較之非特發(fā)性側凸及正常組低。
　　 (4)重度(Cobb≥60°)IS患者椎旁肌中褪黑素水平與NF-kB活性呈負相關，但外周血中無此相關性。
　　 3.上述檢測結果與患者臨床指標進行相關性分析
　　 (1)重度(Cobb≥60°)IS患者椎旁肌中褪黑素水平與胸彎型、側凸進展、側凸嚴重度具有相關性。
　　 (2)重度(Cobb≥60°)IS患者椎旁肌中NF-κB水平與胸

14、彎型、側凸進展、側凸嚴重度同樣具有相關性。研究結果提示:褪黑素及NF-κB在側凸發(fā)生過程中的作用尚不明確，但在其發(fā)展過程中起重要作用。
　　 動物實驗
　　 1.建立脊柱側凸模型
　　 切除雛雞（孵化3天的小雞）松果體建立特發(fā)性脊柱側凸動物模型;本研究動物模型成功建立，松果體切除組有65.4％出現(xiàn)側凸(Cobb＞10°)。術后發(fā)生側凸畸形的雞，畸形種類多種多樣，且術后3月，脊柱側凸角度進一步加重。
　　

15、2.NF-κB活性及含量的檢測
　　 發(fā)生側凸的雞2周時血中的NF-κB濃度較對照組、未發(fā)生側凸的雞高;3個月時監(jiān)測:血、椎板中濃度同對照組無明顯差異，椎旁肌中的NF-κB濃度較對照組、未發(fā)生側凸的雞高。
　　 3.觀察褪黑素水平及其受體基因表達與NF-κB之間的關系:
　　 2周時夜間褪黑素水平在切除松果體己發(fā)生脊柱側凸和未發(fā)生脊柱側凸的兩組動物中均明顯降低，較對照組差異明顯;3個月時，各種組織中褪黑素水平仍較

16、低。
　　 研究結果提示:血中、骨組織中可能有其他因素參與代償機制，使得NF-κB活性恢復正常，也提示上述兩種因子可能對椎旁肌的影響最大。
　　 4.探討NF-κB反義寡核苷酸在調控NF-κB活性中的作用:
　　 結果顯示:脊柱側凸的雞，在使用反義寡核苷酸干預時，血、椎板、椎旁肌中NF-κB的活性均迅速降低。但是重復3次試驗后，重復性不高，特異性比較差。
　　 [結論]
　　 本研究針對脊柱側凸這

17、一世界難題，以臨床特發(fā)性脊柱側凸患者和雛雞脊柱側凸動物模型為研究對象，采用分子生物學研究方法，以NF-κB信號傳導途徑為研究靶點，(1)觀察了臨床特發(fā)性脊柱側凸患者血液及骨及軟組織NF-κB活性、褪黑素水平及其受體基因表達、并將組織學結果與患者臨床指標進行相關性分析;(2)切除雛雞松果體建立特發(fā)性脊柱側凸動物模型，檢測其組織NF-κB活性及含量、褪黑素水平及其受體基因表達、并將組織學結果與患者臨床指標進行相關性分析;(3)以特發(fā)性脊柱側

18、凸的動物模型為研究對象，檢測了采用NF-κB反義寡核苷酸干預NF-κB的活性。
　　 結果顯示:(1)特發(fā)性脊柱側凸發(fā)生機制復雜，多因素作用的結果;(2)褪黑素及NF-κB在側凸發(fā)生過程中的作用不明確;(3)褪黑素及NF-κ B在側凸的發(fā)展過程中起著重要的作用;(4)褪黑素及NF-κB的重要作用位點是椎旁肌;(5)需要進一步行基因水平的研究以闡述其機制。
　　 本課題擬在前期工作的基礎上，在分子生物學水平，從信號傳導角度