白紋伊蚊miR-252對登革病毒E蛋白表達及登革病毒復制的調節(jié)作用.pdf

1、背景:登革病毒(dengue virus，DENV)是地理分布最廣的蟲媒黃病毒，按抗原性可分為DENV-1～DENV-4四個血清型，同一血清型內又可分成不同的基因型。登革病毒的基因組為單股正鏈RNA分子，具有感染性，分子量為3，800 kDa，約含11，000個堿基。在病毒基因組5'-UTR和3'-UTR之間為病毒的單一開放讀碼框架(open reading frame，ORF)，編碼一個約含3400個氨基酸殘基的、分子量約380kDa

2、的聚蛋白分子。人感染登革病毒后根據臨床表現嚴重程度，分為登革熱(dengue fever, DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)、登革休克綜合征(the dengue shock syndrome， DSS)。可傳播登革病毒的蚊種主要為埃及伊蚊(Aedes aegypti，Ae.aegypti)和白紋伊蚊(Aedes albopictus，Ae.albopictus)。白紋伊蚊主要分布在亞洲熱帶

3、、亞熱帶和部分溫帶地區(qū)，現已傳播到北美、南美、歐洲和非洲大陸，對DENV-1～DENV-4均高度易感，在我國為登革的主要傳播媒介。隨著全球氣候變暖、生態(tài)環(huán)境的惡化、蟲媒分布區(qū)域的擴展，登革的流行范圍和頻率不斷增加。近十年來，登革熱在全世界的發(fā)病率提高了將近30倍，目前已波及全球100余個國家和地區(qū)，主要流行于非洲、南美洲、東南亞和西太平洋地區(qū)。自20世紀90年代以來，除海南、福建、浙江和江蘇省有登革熱爆發(fā)外，我國的登革熱主要在廣東省流行

4、，已成為流行區(qū)域面臨的社會公共衛(wèi)生問題。
　　 microRNAs(miRNAs)是一類長度為～22核苷酸(nucleotide，nt)的內源性小分子非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中，可在轉錄后水平調節(jié)基因的表達，參與調控發(fā)育、細胞增值與分化、細胞凋亡、脂類代謝、激素分泌、機體免疫以及腫瘤發(fā)生、病毒感染等生理及病理過程。動物細胞中絕大部分miRNA由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成miRNA初始轉錄產物(primary miRNA，

5、pri-miRNA)，在Pasha/DGR8的協(xié)同下，核酸酶Drosha將pri-miRNA切割成miRNA前體(precursor miRNA，pre-miRNA)。pre-miRNA由Exportin-5蛋白從細胞核內運送至細胞質中，然后經胞質內核酸酶Dicer的切割而加工成～22nt的miRNA:miRNA*雙螺旋結構。雙螺旋結構中的miRNA*通常迅速被降解;另一條5'端穩(wěn)定性較低的鏈即成熟的miRNA(mature miRNA

6、)則與Argonaute(Ago)蛋白家族成員結合進入RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencingcomplex，RISC)。miRNA引導RISC結合靶mRNA后在胞漿中積聚于P小體(P body)內，miRNA可能在P小體中行使其基因沉默功能。經典的理論認為，miRNA能抑制基因的表達，miRNA利用其5'端2～8個堿基的“種子”序列(seedsequence)識別靶基因mRNA3'-UTR的互補序列，引起靶基

7、因mRNA的降解或者是翻譯抑制。但目前有研究發(fā)現miRNA的靶序列也可位于靶基因的5'-UTR區(qū)和編碼區(qū)中，miRNA亦可增強基因的表達。
　　 近年的研究提示病毒與宿主在miRNA水平存在相互的調節(jié)作用。一方面病毒自身可編碼miRNA，利用其促進病毒自身復制與潛伏并抑制宿主細胞抗病毒活性;另一方面宿主細胞編碼的大量miRNAs，在調控自身基因表達的同時，可調控入侵病毒的復制。Lecellier等發(fā)現哺乳動物細胞的miR-32可

8、抑制Ⅰ型泡沫病毒(primate foamy virus type1，PFV-1)的復制。Pedersen研究者通過序列互補分析發(fā)現5種受IFN-B調節(jié)的miRNA對HCV復制有明顯抑制作用;細胞轉染人工合成的miRNA類似物(miRNA mimic)混合物能使HCV mRNA水平顯著下降，而轉染相應的反義miRNA抑制劑(miRNA inhibitor)能降低IFN-B的抗病毒作用。Triboulet等人發(fā)現敲除Dicer或Drosh

9、a可明顯增強Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV-1)感染者外周血單個核細胞(Peripheralbloodmononuclear cell，PBMC)中病毒的復制，提示細胞miRNA對HIV-1的復制具有負調節(jié)作用。Hariharan等研究發(fā)現5種人miRNA在HIV基因組中能找到靶標序列，miR-29a和miR-29b靶向nef基因，miR-149靶向vpr基因，miR-378靶向en

10、v基因，miR-324-5P靶向vif基因;這些靶序列在所有HIV病毒包膜序列中高度保守，提示細胞miRNA水平可能與HIV-1感染及病程相關。Yeung等應用基因表達譜芯片技術研究HIV感染的人T細胞中miRNA表達的變化，上述提到的5種miRNA水平顯著下調，提示細胞miRNA在HIV病毒-宿主相互作用中起重要作用。宿主miRNA也可被病毒利用促進其維持潛伏或增進復制。Jopling和Roberts等發(fā)現肝細胞特異性豐富表達的miR

11、-122可與HCV基因組5' UTR區(qū)的兩個互補序列相互作用，增強HCV在肝細胞中的復制。宿主細胞的miR-342-5p和miR-10a(miR-10a*)可分別靶向柯薩奇病毒B組(Group B coxsackieviruses，CVB)的2C編碼區(qū)和3D編碼區(qū)，抑制或增強CVB的復制，提示宿主細胞miRNA可識別CVB靶基因編碼區(qū)的互補序列，并在轉錄后水平調控病毒基因的表達，進而影響病毒的復制和增殖。
　　 蚊是非常重要的蟲

12、媒病毒傳播媒介，目前僅有岡比亞按蚊、斯氏按蚊、埃及伊蚊、致倦庫蚊以及白紋伊蚊鑒定出miRNAs。Winter等利用鳥槍克隆及生物信息學分析第一次證實了岡比亞按蚊18個miRNAs的存在。Mead等發(fā)現和鑒定了斯氏按蚊中的23個保守miRNAs和及4個新miRNAs。Li等發(fā)現了86個埃及伊蚊miRNA。Skalsky等采用高通量深度測序的方法從白紋伊蚊的C7/10細胞中鑒定出65個miRNA，從庫蚊中鑒定出77個miRNAs。對蚊蟲mi

13、RNAs的功能了解得非常有限，有研究表明病原體入侵可影響蚊miRNAs表達水平。Winter等發(fā)現岡比亞按蚊miR-34在瘧原蟲感染后表達量上調5倍，而miR-12和miR-281表達量下降3倍，敲除Dicer1和Ago1 mRNA后的岡比亞按蚊對瘧原蟲的易感性升高，提示瘧原蟲的感染可能與岡比亞按蚊miRNA的表達差異相關，miRNAs可能參與岡比亞按蚊抗瘧原蟲感染。Osei-Amo等發(fā)現Wolbachia病毒感染前后的埃及伊蚊細胞內的

14、miR-12呈現表達差異，提示miR-12可能和病毒的感染相關。Sckaly等用西尼羅病毒感染白紋伊蚊C7/10細胞，miR-989和miR-92表達量沒有明顯變化，同樣條件下感染庫蚊，發(fā)現miR-989表達水平下調，而miR-92表達上調;提示蚊miRNAs表達差異可能與病毒感染有關。最近的研究證實埃及伊蚊的miR-375可通過抑制NF-kB轉錄因子的活性而增強DENV-2的感染。
　　 本課題組吳錦雅博士、鄭培民碩士運用so

15、lex測序和Northern blot的方法在白紋伊蚊成蚊中檢測到miRNAs，并檢測到雌蚊經胸腔注射登革病毒后，蚊體內大量miRNAs出現表達差異，提示miRNAs可能在白紋伊蚊抗登革病毒感染中起調控作用。
　　 目的:我們在白紋伊蚊C6/36細胞中建立登革病毒蚊體外感染模型，期待通過了解登革病毒感染前后C6/36細胞中miRNAs表達水平的變化，挑選在C6/36細胞中表達量豐富并且在登革病毒感染前后變化幅度較高的miRNAs

16、，預測其在登革病毒基因組中可能的靶標基因;測定miRNAs表達水平的變化對靶基因表達水平的影響，初步探討蚊細胞內miRNA對登革病毒感染的調控作用，為登革病毒的防治提供一個新的思路。
　　 方法:建立白紋伊蚊C6/36細胞DENV-2感染模型，使用實時定量PCR(real timequantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)測定DENV-2感染前后C6/36細胞內miRNAs的表

17、達差異。使用RNAhybrid軟件預測3種我們感興趣的miRNAs在DENV-2基因組中的靶標，選擇在C6/36細胞中表達水平較高并在DENV-2感染前后表達量變化明顯的miR-252，通過RT-qPCR/western blot測定C6/36細胞在轉染miR-252人工合成的類似物(mimic)或者反義抑制物(inhibitor)后，其預測的靶基因—登革病毒包膜蛋白(envelop protein，E protein)RNA/蛋白表達

18、水平的變化，了解miR-252在抗登革病毒感染中的作用。
　　 結果:白紋伊蚊C6/36細胞感染DENV-2后，細胞內miR-252表達水平增高。經配對t檢驗，與對照組比較，在感染后24小時(hour，hr)，miR-252表達水平增高3.2倍(t=-9.850，P=0.010)，在感染后72 hrs，miR-252表達水平增高2.1倍（t=-6.751，P=0.021）。在DENV-2感染的白紋伊蚊C6/36細胞細胞中轉染mi

19、R-252 mimic，增強miR-252的表達(24 hrs，t=-89.337，P＜0.001;72hrs，t=-28.508，P=0.001)，可降低DENV-2 RNA的表達(72 hrs，t=24.319，P=0.002)，western blot顯示E蛋白的表達受到抑制;反之，在DENV-2感染的白紋伊蚊C6/36細胞中轉染miR-252 inhibitor，降低細胞內miR-252水平(24hrs，t=16.381，P=0

20、.004;72hrs，t=33.680，P=0.001)，可增強DENV-2 RNA的表達(72 hrs，t=-43.250，P=0.001)，并可使E蛋白表達量增高。轉染了miR-252inhibitor的C6/36 cells上清液中的DENV-2滴度明顯增高，與陰性對照相比較，P=0.034;與mock相比較，P=0.019。將包含有與miR-252種子序列互補的E蛋白跨膜區(qū)克隆入海腎熒光素酶報告載體中，經方差分析檢驗，與對照組比