人骨髓間充質干細胞體外擴增及其免疫調節(jié)作用的實驗研究.pdf

1、目的：研究骨髓間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)對PHA或異體抗原作用下的T淋巴細胞分泌功能的免疫調節(jié)作用，初步探討MSCs誘導免疫耐受，降低移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)發(fā)生率的機制。 研究方法：通過Fico11分離法分離骨髓單個核細胞，體外培養(yǎng)擴增出MsCs，并通過形態(tài)學特征及流式細胞術檢測其表面標志加以鑒定。通過Ficoll分離法和尼龍棉柱

2、法獲取外周血T淋巴細胞，將不同數(shù)量的MSCs與PHA活的T細胞共培養(yǎng)4天，收集培養(yǎng)上清液；將不同數(shù)量的MSCs加入混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)體系共培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)上清液；將不同濃度的MSCS培養(yǎng)上清加入MLR體系共培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)上清液。應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分別檢測各培養(yǎng)上清液中T細胞分泌的細胞因子水

3、平，包括IL-2和INF-Y(主要由Thl細胞分泌)，IL-4和IL-10(主要由Th2細胞分泌)。 結果：骨髓單個核細胞接種于培養(yǎng)瓶后，2～4天可見成纖維樣貼壁細胞逐漸出現(xiàn)，增殖速度較慢；7～11天散在的成纖維樣貼壁細胞增殖較快，細胞形態(tài)均一；2周左右，細胞生長呈漩渦狀或平行狀排列，細胞融合可到達90％。傳代細胞生長迅速，主要呈成纖維樣，約第7～10天可達到融合。流式細胞儀檢測人骨髓MSCs表面抗原高表達CD29、CD105、

4、CD166：而低表達CD34、CD45、HLA-DR。與未加骨髓MSCs的對照組A相比，不同細胞數(shù)量的MSCs和PHA作用下的T淋巴細胞共培養(yǎng)4天后，骨髓MSCs抑制T細胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-2(P<0.05)。骨髓MSCs對IFN-γ和IL-2的影響顯著，對IL-4的影響較低，且這種抑制作用呈MSCs數(shù)量依賴性(P<0.05)。骨髓MSCs促進了IL-10的分泌(P<0.05)，這種促進作用在MSCs>1×10<'4>時呈

5、MSCs數(shù)量依賴性(P<0.05)。 與未加骨髓MSCs的對照組B相比，不同細胞數(shù)量的MSCs加入MIC體系中共培養(yǎng)7天后，骨髓MSCs抑制T細胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-2(P<0.05)。骨髓MSCs對IFN-γ的影響明顯，且這種抑制作用呈數(shù)量依賴性(P<0.05)；骨髓MSCs對IL-2、IL-4分泌的抑制作用較低，且與MSCs數(shù)量多少無關系。MSCs>5×10<'3>時，骨髓MSCs促進了T細胞IL-10的分泌

6、(P<0.05)，且這種促進作用存在數(shù)量依賴性(P<0.05)。 與未加骨髓MSCs培養(yǎng)上清的對照組C相比，不同濃度的骨髓MSCs培養(yǎng)上清液加入MLC體系中共培養(yǎng)7天后，培養(yǎng)上清可以抑制T細胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-2(P<0.05)。上清液對IFN-γ的影響明顯，且這種抑制作用呈MSCs培養(yǎng)上清濃度依賴性(P<0.05)；在MSCs培養(yǎng)上清濃度≤50％時，MSCs對IL-2分泌抑制作用亦呈濃度依賴性(P<0.05)，

7、但作用輕微；MSCs對IL-4抑制作用與加入上清量多少無關。骨髓MSCs培養(yǎng)上清液不影響IL-10的分泌(P>0.05)。 結論： 1．采用密度梯度分離法和貼壁篩選法相結合能夠成功體外擴增培養(yǎng)出間充質干細胞，且其具有均一的表面標志； 2．在PHA或異體抗原存在的情況下，MSCs均可抑制Th1細胞分泌IL-2和IFN-γ，但對Th2細胞分泌IL-4和IL-10的作用相反，其對Th2細胞亞群的作用有待進一步證明。此外