豬呼吸道上皮細胞抗病毒miRNAs鑒定.pdf

1、豬呼吸系統(tǒng)疾病(Swine respiratory diseases，SRD)嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，它的致病機理復雜，可以由一種或多種病毒、細菌、寄生蟲引起，也可隨著環(huán)境、營養(yǎng)、應激和豬只自身健康程度的變化而改善或加重。病毒是SRD的主要病原菌之一，天然免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRR)與病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associatedmolecular patte

2、rn，PAMP)相互作用，識別病毒并啟動相應信號轉(zhuǎn)導通路，啟動合成干擾素、白細胞介素等細胞因子及一系列下游抗病毒相關(guān)分子，抑制病毒在體內(nèi)的增殖。上皮細胞不僅是病原微生物入侵呼吸道的物理屏障，還能啟動天然免疫反應抵御病毒入侵，是防御呼吸道疾病的第一道屏障。miRNAs是生物體內(nèi)的一類長度約21～25nt的非編碼小RNA，通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達而參與各項生命活動，已有研究表明miRNAs與機體的疾病抗性/易感性密切相關(guān)。解析呼吸道上皮

3、細胞抗病毒天然免疫反應的分子機制，鑒定抗病毒相關(guān)miRNAs及其作用，是防治呼吸道疾病的關(guān)鍵。大多數(shù)病毒的PAMP是雙鏈RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)，人工合成的dsRNA-Poly(I∶ C)能夠有效地激活機體的抗病毒天然免疫反應。因此，本研究利用Poly(I∶ C)刺激原代培養(yǎng)的豬呼吸道上皮細胞，通過高通量測序技術(shù)分析對照組和刺激組miRNAs的表達和編輯情況、鑒定新miRNAs，在此基礎(chǔ)上，選擇感興趣

4、的miRNAs進行靶基因鑒定和誘導表達、組織表達分析，并分析了miR-20a對細胞生長、遷移、自噬及炎性細胞因子表達的影響。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用組織塊原代培養(yǎng)法和差速貼壁純化法，成功獲得了豬呼吸道上皮細胞，經(jīng)角蛋白CK18單克隆抗體鑒定，確定為上皮類型的細胞，且純度較高。⑵經(jīng)HiSeq高通量測序，對照組和處理組各得到13，339，772和11，987，962條純凈序列，序列長度集中在18～26 nt之間，峰值位于22

5、nt;獲得差異表達顯著的miRNAs23個(p＜0.01，|log2ratio|＞1)，其中19個在Poly(I∶ C)刺激下下調(diào)表達，4個上調(diào)表達。利用MIRANDA、TARGETSCAN和PICTAR三個軟件，共同預測到386個基因是差異表達的miRNAs潛在靶序列，這些靶基因主要富集在細胞生長調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的正負調(diào)控、胚胎發(fā)育、細胞信號傳導等生物過程方面(p＜0.05)。⑶隨機選取兩個差異表達miRNAs(miR-10

6、1和miR-20a)，利用雙熒光素酶報告基因分析和定點突變方法對生物信息學預測的潛在靶基因進行實驗驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-101能有效地抑制所選取的所有潛在靶基因（SOX9，TLK2，RANBP9，BCL9，EZH2，SOCS5，CDH11和DR1）的表達，在選取的8個潛在靶基因中，miR-20a能對其中的5個（HLF，ITGB8，ARID4B，SLC40A1和MAP3K2）進行調(diào)控，對ENNP5，F(xiàn)BXL5和GPR6基因的表達無影響。⑷

7、測序表明miRNAs中存在大量的堿基編輯現(xiàn)象，處理組和對照組分別有78和87個miRNAs發(fā)生編輯，占所檢測到miRNAs總數(shù)的57.35％和62.14％，堿基編輯包含所有的堿基替代類型，其中以A＞G堿基編輯形式最多，在對照組和處理組中分別占27.89％和29.38％，其次為G＞A(12.2％和12.59％)和G＞T(11.39％和11.9％)。Poly(I∶ C)處理對堿基編輯產(chǎn)生一定的影響:對照組和處理組中各存在14種和5種特有的堿

8、基編輯現(xiàn)象;miRNAs成熟序列5'端第5個堿基的編輯也在對照組和處理組中表現(xiàn)出差異。雙熒光素酶報告基因和定點突變實驗表明，第5個堿基編輯對miRNAs識別和結(jié)合靶基因具有重要影響，當突變掉第5個堿基(G/T)后，miR-101失去了對靶基因的識別、結(jié)合能力。⑸在處理組和對照組中分別檢測到83條和82條新的miRNAs，其中47個在兩組中共同存在。物種間保守性分析顯示，共有19個新miRNAs可以在其他物種中找到同源序列，隨機選取其中的

9、6個新miRNAs（NS-1、NS-2、NS-3、NS-6、NS-8和NS-9）進行克隆測序，證明了這些miRNAs確實存在于豬中。誘導表達分析發(fā)現(xiàn)，NS-2、NS-8和NS-9在不同濃度Poly(I∶ C)刺激下表達量變化顯著(p＜0.05);組織表達分析發(fā)現(xiàn)，NS-2、NS-8和NS-9在1月齡民豬13個組織中（心、肝、脾、肺、腎、胃、舌、膀胱、小腸、大腸、脂肪、背最長肌和皮膚）均表達，但表達模式各不相同。⑹細胞生長曲線實驗證明，過

10、表達miR-20a可以縮短pk15細胞在生長遲緩區(qū)停留的時間，提前進入對數(shù)生長階段，顯著促進細胞的增殖(p＜0.05)，抑制miR-20a的表達會顯著減緩細胞的增殖(p＜0.05);細胞劃痕試驗證明過表達miR-20a后，各觀測時間點pk15細胞的相對遷移率均顯著高于對照組(p＜0.05)，抑制miR-20a的表達會顯著降低細胞的遷移率(p＜0.05)。⑺Real-time PCR檢測miR-20a對5個細胞因子(IFN-β、IL-29