白藜蘆醇保護神經干細胞氧糖剝奪損傷的實驗研究.pdf

1、實驗一、化學自調控缺氧盒的設計及應用
　　【研究背景】近年來,缺血性腦卒中發(fā)病率成明顯的上升趨勢,因此對缺血性腦卒中進行有效的防治具有及為重要的意義。明確其細胞分子機制是研究防治缺血性腦損傷的關鍵。細胞體外培養(yǎng)氧糖剝奪模型是目前最常用的模擬機體缺血、缺氧的實驗方法,缺氧條件的構建是細胞氧糖剝奪實驗的先決因素。目前,常用的缺氧細胞培養(yǎng)設備是無氧孵箱,其主要的工作原理是通過無氧混合氣體替換出孵箱中的空氣來實現缺氧。然而,無氧孵箱的體積

2、大,無氧氣體替換空氣的效率較低,并需要持續(xù)通入無氧氣體才能維持缺氧狀態(tài)。設計一種簡單、便攜、易操作并且能自動地維持缺氧狀態(tài)的缺氧盒成為迫切需求。
　　焦性沒食子酸水溶液在常溫條件下相對穩(wěn)定,而其堿性溶液能夠快速地與空氣中的氧發(fā)生反應,這一特點明顯有別于其他氧氣清除劑。因此,用焦性沒食子酸與氫氧化鈉構成的堿性溶液作為氧氣清除劑,是一較為理想的選擇。
　　細胞培養(yǎng)需要穩(wěn)定的酸堿環(huán)境,Na2HPO4/NaH2PO4和NaHCO3/

3、H2CO3是常見的水溶液緩沖對,緩沖液能夠維持其溶液穩(wěn)定的PH值環(huán)境,穩(wěn)定的二氧化碳濃度與溶液中NaHCO3能夠維持一個相對穩(wěn)定的PH值。
　　我們應用這些物理和化學特點設計了一種簡易的化學自動調控缺氧盒,該缺氧盒既能滿足缺氧、也能滿足二氧化碳濃度的要求。
　　【目的】設計一種化學自調控缺氧細胞培養(yǎng)盒,并探討其可行性和實驗使用方法。
　　【方法】將1.5L密封盒改裝成缺氧盒。將11.5g氫氧化鈉和2.6g碳酸鈉溶于55

4、ml水中,18g焦性沒食子酸溶于100ml水中,先后注入到密封真空輸液袋內,配成焦性沒食子酸堿性溶液,并將焦性沒食子酸堿性溶液輸注到缺氧盒內,要求加注時間不超過2min,用來快速地清除培養(yǎng)盒內的氧氣。30min后再將47.8g二水磷酸二氫鈉溶于110ml水中,并注入到缺氧盒內。NaH2PO4與氫氧化鈉、碳酸鈉化學反應用部分生成Na2HPO4,Na2HPO4/NaH2PO4構成基礎緩沖對,維持化學反應液的PH值。碳酸鈉之后部分生成NaHC

5、O3和H2CO3,并進一步通過NaHCO3/H2CO3緩沖對維持缺氧盒內二氧化碳濃度,在化學反應液中Na2HPO4/NaH2PO4的量遠大于NaHCO3/H2CO3。因此,二氧化碳的釋放對化學反應液的pH值影響較小。用測氧儀檢測盒內氧氣濃度,并以二氧化碳測量儀檢測二氧化碳的濃度,應用pH儀測化學反應液的pH值,再用血氣分析儀檢測細胞培養(yǎng)基的pH值。以U87、U251和骨髓間充質干細胞為實驗細胞,對照組將盒內持續(xù)通入95％N2+5%CO2

6、混合氣體使氧濃度低于0.2%,CCK-8測量缺氧盒組與95%N2+5%CO2組細胞活性進行比較。每一組實驗指標均重復5次。
　　【結果】將18g焦性沒食子酸、11.5g氫氧化鈉和2.6g碳酸鈉配成的堿性吸氧液注入到缺氧盒內并計時,測量盒內氧氣的體積濃度,在5min時氧濃度為0.592%±0.0798%,10min為0.238%±0.0278%,15min為0.200%±0.02236%,30min為0.194%±0.01342%,

7、24h為0.194%±0.0321%。氧濃度在10min后趨于穩(wěn)定,10min、15min、30min、24h相互比較無明顯差異(P>0.05)。30min時將磷酸二氫鈉溶液注入到盒內,24h時測量盒內二氧化碳濃度為5.03%±0.19%,化學反應液pH值為7.93±0.026。在密封條件下抽取細胞培養(yǎng)基測量pH值,于15min,30min,1h和24h的結果分別為:7.402±0.0156,7.341±0.0354,7.308±0.0

8、365和7.311±0.0304。除15min細胞培養(yǎng)基pH略升高外,其余時間點的細胞培養(yǎng)基pH值均無明顯變化,維持在7.0-8.0之間。采用U87、U251和骨髓間充質干細胞作為實驗細胞,以95%N2+5%CO2替換盒內氣體為對照(氧濃度低于0.2%),所致的細胞損傷及細胞活性檢測,均無明顯差異(P>0.05)。
　　【結論】根據焦性沒食子酸的特殊化學性質以及緩沖液的特點,設計的缺氧盒之缺氧效果好,盒內二氧化碳濃度穩(wěn)定,經觀察與

9、95%N2+5%CO2組比較無明顯差異,它能夠滿足缺氧實驗的需求。
　　實驗二、白藜蘆醇預處理對神經干細胞氧糖剝奪損傷的保護作用
　　【研究背景】神經系統(tǒng)受損后修復能力有限,神經干細胞及神經前體替換損傷神經細胞為神經系統(tǒng)的修復提供了有利條件。但是,缺血性腦卒中及再通后,其內環(huán)境發(fā)生了較大的變化,這對干細胞的存活與生長會產生嚴重的影響。白藜蘆醇(Resveratrol,Res)是多酚類藥物,廣泛存在于自然界植物中。研究發(fā)現,R

10、es可以激活SIRT1,并通過SIRT1相關通路對細胞保護發(fā)揮作用,可提高神經細胞的耐缺氧能力。本課題從缺血損傷的基本因素出發(fā),研究Res預防神經損傷的機制,以及增強神經干細胞生存能力的有效方法,將為神經損傷修復及神經干細胞的臨床應用提供新的證據和研究思路。
　　【目的】探討Res預處理對神經干細胞氧糖剝奪損傷的有效保護作用。
　　【方法】取自孕15dSD大鼠胎腦組織進行分離、培養(yǎng),通過免疫組化鑒定巢蛋白表達情況,鑒定其神經

11、干細胞的特性;用含有Res10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L和60μmol/L培養(yǎng)液預處理,培養(yǎng)神經干細胞1h,同時對照組加入含0.1%DMSO培養(yǎng)液。更換低糖培養(yǎng)基后,將細胞置于本研究創(chuàng)用的缺氧盒內,進行培養(yǎng)氧糖剝奪的實驗,時間為6h;采用四唑鹽比色實驗檢測細胞活性;收集培養(yǎng)基上清,通過測量上清中乳酸脫氫酶活性,檢測細胞損傷情況。
　　【結果】原代胎鼠腦組織分離培養(yǎng)5d后可見神經球形成,細胞爬片及神經球免疫組化

12、鑒定結果,見巢蛋白表達陽性,所培養(yǎng)的細胞為神經干細胞;Res處理1h后OGD6h測細胞活性。10μmol/L和20μmol/L組MTT值相對于對照組有統(tǒng)計學意義(n=7,p<0.01),表明10μmol/L和20μmol/LRes預處理1h對神經干細胞耐氧糖剝奪損傷有保護作用;20μmol/L組LDH活性相對于對照組有統(tǒng)計學意義(n=5,p<0.01),細胞損傷較輕。
　　【結論】Res預處理1h對神經干細胞氧糖剝奪損傷有保護作用