結(jié)直腸癌變相關(guān)基因表達(dá)譜的研究.pdf

1、該博士學(xué)位論文由相互聯(lián)系的三部分工作組成。
　　 第一部分:人腸發(fā)育與結(jié)直腸癌變相關(guān)基因表達(dá)譜的整合研究
　　 研究表明胚胎發(fā)育與腫瘤發(fā)生在組織、細(xì)胞及分子水平有很多相似之處。因此，可以借助胚胎發(fā)育來研究腫瘤，為探索腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的線索。本部分研究通過檢測人腸發(fā)育過程3個時間點（妊娠早期胎腸6例、妊娠中期胎腸8例、正常成人腸12例）和結(jié)直腸癌變3個階段（正常成人腸12例、低級別腺瘤71例、高級別腺瘤33例、腺癌4

2、7例）組織的mRNA表達(dá)譜，分別分析發(fā)育和癌變過程基因表達(dá)特征，進(jìn)而對兩個過程的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。結(jié)果顯示，腸發(fā)育過程中表達(dá)上調(diào)的基因主要參與免疫應(yīng)答、抗原遞呈、離子轉(zhuǎn)運、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程，表達(dá)下調(diào)的基因主要參與DNA復(fù)制、染色質(zhì)組裝、DNA和RNA代謝、細(xì)胞粘附、細(xì)胞組織形態(tài)發(fā)生和組織器官發(fā)育等生物學(xué)過程。結(jié)直腸癌變過程中表達(dá)上調(diào)的基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、胚胎形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞外基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)、血管生成、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖等過程

3、;表達(dá)下調(diào)的基因主要參與免疫應(yīng)答、免疫細(xì)胞激活、防御反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)等過程。腸發(fā)育和癌變相關(guān)基因表達(dá)譜整合分析顯示，結(jié)直腸腫瘤的基因表達(dá)特征與胎腸組織相似，且隨著腫瘤的進(jìn)展，其分子表達(dá)譜越接近胎腸發(fā)育的早期階段，可見發(fā)育過程和癌變過程的mRNA表達(dá)具有動態(tài)聯(lián)系?；谏鲜瞿c發(fā)育和結(jié)直腸癌變的分子特征，進(jìn)一步篩選出兩組表達(dá)趨勢相反的基因簇，一簇基因在腸發(fā)育過程中表達(dá)逐漸升高而在癌變過程中表達(dá)逐漸降低，主要與免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡相關(guān)

4、;另一簇基因在腸發(fā)育過程中表達(dá)逐漸降低而在癌變過程中表達(dá)逐漸升高，主要與細(xì)胞增殖相關(guān)。本部分研究結(jié)果提示，人腸發(fā)育過程與結(jié)直腸癌變過程相關(guān)mRNA表達(dá)譜具有相似性，結(jié)直腸癌變過程相關(guān)的分子事件可能是胚胎腸發(fā)育相關(guān)分子事件的再激活或再抑制。以腸發(fā)育為切入點，整合分析腸發(fā)育與結(jié)直腸癌變的內(nèi)在聯(lián)系，為結(jié)直腸腫瘤的研究提供了新的思路。
　　 第二部分:結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變相關(guān)基因與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系
　　 腫瘤細(xì)胞形態(tài)和行為等方

5、面的異質(zhì)性是由（表觀）遺傳學(xué)改變的持續(xù)積累所導(dǎo)致的，還是由腫瘤起始細(xì)胞在早期階段就已經(jīng)建立的固有特征所決定的，仍然是一個有爭議的問題。多年前，有研究者提出人類腫瘤的生物先決論假說，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)潛能在癌前階段就已經(jīng)決定。本部分研究的目的就是為了探索在腫瘤起始階段發(fā)生的異常分子事件是否可以影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展。本部分研究采用mRNA表達(dá)譜芯片和miRNA表達(dá)譜芯片分別對結(jié)直腸正常黏膜、低級別腺瘤、高級別腺瘤和腺癌組織進(jìn)行了分析。結(jié)果顯

6、示，與低級別腺瘤轉(zhuǎn)變?yōu)楦呒墑e腺瘤、直至腺癌的過程相比，mRNA和miRNA的表達(dá)在正常腸上皮發(fā)展為低級別腺瘤的階段發(fā)生了更大的改變，包括2，322個差異表達(dá)mRNAs和71個差異表達(dá)miRNAs。利用這些早期的分子變化，我們構(gòu)建了一個miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，包括30個miRNA及其調(diào)控的166個靶基因。在這些基因中，由5個miRNA調(diào)控的55個基因組成的標(biāo)志物，在三組獨立數(shù)據(jù)集中均與結(jié)直腸癌患者的總生存時間或無病生存時間相關(guān)。

7、因此，從正常腸上皮轉(zhuǎn)化為上皮內(nèi)瘤變的階段中，轉(zhuǎn)錄組水平上的分子改變可能會影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展。
　　 第三部分:結(jié)直腸正常黏膜和結(jié)直腸癌相關(guān)保守基因簇的初步研究
　　 本部分研究通過對人結(jié)直腸正常黏膜組織及腺癌組織的基因表達(dá)譜分析，挑選出差異表達(dá)基因?qū)Γ瑯?gòu)建結(jié)直腸正常黏膜和腺癌組織中特異表達(dá)的基因簇，為揭示結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理提供新的線索。研究采用mRNA表達(dá)譜芯片，對12例正常結(jié)直腸黏膜、21例低級別腺瘤、30例高

8、級別腺瘤和25例結(jié)直腸癌組織進(jìn)行了分析。生物信息學(xué)分析篩選出結(jié)直腸癌變各階段特異的共表達(dá)基因?qū)?，并利用正常黏膜和腺癌兩個階段的數(shù)據(jù)，構(gòu)建并篩選出分別在正常結(jié)直腸組織和癌組織中特異表達(dá)的子網(wǎng)絡(luò)/基因簇，即保守基因簇。正常黏膜相關(guān)保守基因簇的功能包括免疫細(xì)胞激活、補體激活和器官形態(tài)發(fā)生等;腺癌相關(guān)保守基因簇的功能包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞運動和細(xì)胞粘附等。進(jìn)一步預(yù)測每個保守基因簇上游潛在的調(diào)控基因，并挑選3個保守基因簇（1個正常相關(guān)和2個腺癌相關(guān)保

9、守基因簇）中的11個基因及8個預(yù)測的調(diào)控基因在上述起始樣本（12例正常和22例腺癌組織）及獨立樣本（13例正常和19例腺癌組織）中使用實時定量PCR的方法對其表達(dá)水平進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示，19個基因在起始樣本和獨立樣本中差異表達(dá)的陽性率分別為84.21％(16/19)和42.11％(8/19)。此外，在細(xì)胞中外源過表達(dá)MAFB引起cluster16中基因（RAB31，MYO5A，WIPF1和LCP1）的mRNA表達(dá)水平上調(diào)。因此，我們基于